Page 78 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第5期
               ·674 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年5月


              及发展过程      ［3-5］ 。lncRNA TPTEP1 作为抑癌基因被           环阈值，ΔCT=CTTPTEP1-CTGAPDH ），计算TPTEP1的相对表
              证实在肝癌组织中明显低表达，并且通过微小RNA                           达量。TPTEP1引物序列：正向5′⁃ GCTTCCCCTTTC⁃
             （miRNA）⁃454⁃3p调控DLG5表达来抑制肝癌细胞的                     CAGAGAGC⁃3′，反向 5′ ⁃ CGGGCGACTGTAGTGTT⁃
                         ［6］
              生长和转移 。在 StarBase 数据库中，TPTEP1 在肺                  GTT⁃3′；GAPDH引物序列：正向5′⁃CTCACCGGATG⁃
              腺癌组织中呈现了明显的低表达，但其在肺腺癌中                            CACCAATGTT ⁃ 3′ ；反 向 5′ ⁃ CGCGTTGCTCACAAT⁃
              的 具 体 作 用 缺 乏 研 究 ，因 此 本 研 究 旨 在 探 索              GTTCAT⁃3′。
              TPTEP1 在肺腺癌中的表达，尤其是在肺腺癌术前                         1.2.2 细胞转染和分组
              及术后血浆中的表达，探讨其与肺腺癌患者临床特                                 过表达 TPTEP1 慢病毒载体（LV⁃TPTEP1）及其
              征的关系，研究其对肺腺癌细胞生长及转移的作                             对照组（LV⁃Control）由上海吉凯生物技术公司合
              用，以期为肺腺癌的病情评价及靶向治疗提供可行                            成。A549 细胞培养至适合密度后分两组利用 poly⁃
              的生物靶点。                                            brene试剂分别转染LV⁃TPTEP1或 LV⁃Control（称为
                                                                TPTEP1组和Control 组）。培养24 h后，收集细胞提
              1  材料和方法
                                                                取RNA，利用qRT⁃PCR验证转染效率。
              1.1  材料                                           1.2.3 CCK⁃8实验
                  收集2017年6月—2020年12月86例在南京医                          A549 细胞株实验组和对照组分别培养后接种
              科大学第一附属医院接受手术治疗的肺腺癌患者                             到 96 孔板，每孔约 3 000 个细胞，正常培养 24、48、
              癌组织、癌旁组织；同时收集 33 例肺腺癌手术患者                         72、96 h，在不同时间点选择不同复孔（n>4）分别加入
              的术前血浆及术后血浆（术后1个月）样本。所有样                           CCK⁃8试剂，避光培养2 h后测量各孔在450 nm处的
              本取材后立即保存液氮中。术后病理均证实为肺腺                            吸光度。
              癌并剔除临床资料（符合第8版AJCC病理分类）不完                         1.2.4 Transwell侵袭和迁移实验
              整病例。每例患者都签署了知情同意书。本研究得                                 采用 8 μm 孔径的 Transwell 小室进行实验。实
              到了医院伦理委员会的批准（2019⁃SRFA⁃261）。此                     验组和对照组 A549 细胞培养消化后用无血清
              外，本研究还检索了TCGA数据库中TPTEP1与肺腺                        RPMI1640 培养液重悬。侵袭实验时，将小室上层
                              ［7］
              癌预后的相关数据 。                                        均匀涂覆 Matrigel 基质胶；迁移实验时不做涂覆。
                  肺腺癌细胞系A549、SPCA1、H1299、H358、PC⁃9              然后在小室上层加入200 μL无血清细胞悬液，小室
              和正常支气管上皮细胞系 BEAS⁃2B 来自于本实验                        下层中加 500 μL 含 10%胎牛血清的 RPMI1640 培
              室冻存，原始细胞株购自于中国科学院典藏生物                             养液，培养箱中恒温培养 36 h。取出 Transwell 小
              细胞资源中心。细胞培养于含有 10%胎牛血清的                           室，甲醇固定后用 0.1%结晶紫染色 20 min，棉签擦
              RPMI1640 培养基中，放置于 37℃含有 5%CO2的细                   去小室上层面余留细胞，显微镜下进行随机视野
              胞培养箱中培养。                                          拍照后计数。
                  RNA 提取试剂 TRIzol（Invitrogen 公司，美国），            1.3  统计学方法
                                      TM  RT Master Mix、PCR 试        应用 SPSS19.0 和 Graphpad Prism 7.0 进行数据
              逆转录试剂盒 PrimeScript
              剂盒 SYBR Green PCR Kit（南京碧云天科技有限公                  统计学分析，计数资料采用卡方检验；符合正态分
              司），CCK⁃8 试剂盒（同仁公司，日本）。Transwell 小                 布的计量资料，两组比较采用t检验；多组比较采用
              室（Corning 公司，美国），Matrigel 基质胶（BD 公司，              单因素方差分析。采用卡方检验对TPTEP1表达水
              美国）。                                              平与患者临床特征的关系进行分析，P＜0.05 为差

              1.2  方法                                           异有统计学意义。
              1.2.1 RNA提取和实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）
                                                                2  结 果
                  肺癌及癌旁组织、术前及术后血浆采用 TRIzol
              法提取总RNA后反转录为cDNA，利用美国 Applied                     2.1  TPTEP1在肺腺癌患者组织及血浆中的表达水
              Biosystems 公司的 ABI7900 快速实时 PCR 系统进行              平比较
              基因扩增。条件为 95 ℃ 5 min，然后 94 ℃ 15 s，                      选取了 86 例接受肺腺癌手术患者的肿瘤组织
              55 ℃ 30 s，进 行 40 个 循 环 扩 增 。 GAPDH 作 为            及癌旁组织样本，采用 qRT⁃PCR 检测了组织中
              TPTEP1 的内参基因。采用 2         −ΔΔCT 定量法（CT表示循         TPTEP1 的相对表达水平。实验结果如图 1A 所示，
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