Page 52 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
·804 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年6月
照组；LPZ 组中含有 10 μmol/L LPZ；NAC 组中含有 行显影。用Image J 软件对Western blot 条带进行半
1 mmol/L NAC；LPZ+NAC 组中含有 1 mmol/L NAC 定量分析，各给药组目的蛋白的表达用对照组进行
和 10 μmol/L LPZ，各组间 DMSO 含量保持一致，共 标准化。
同培养48 h。 1.3 统计学方法
1.2.2 ROS荧光检测 实验数据以均数±标准差（x ± s）的形式表示，所
对数生长期细胞以 3×10 个/mL 接种至 6 孔细 有数据均使用 Graph Pad Prism 9 软件进行统计分
4
胞培养板，每孔2 mL，置于37 ℃、含5% CO2的培养箱 析，多组间比较使用单因素方差分析，P＜0.05为差
中培养24 h，细胞给药后培养一定时间，用10 μmol/L 异有统计学意义。每项实验均独立重复 3 次，使用
DCFH⁃DA染液于37 ℃培养箱孵育20 min，用无血清 Graph Pad Prism 9软件进行作图。
培养基清洗3次，以488 nm为激发波长在荧光显微
2 结 果
镜下进行观察。
1.2.3 Western blot法检测蛋白表达 2.1 LPZ时间依赖性地诱导氧化应激
对数生长期细胞以3×10 个/mL个接种至6孔细 为了研究LPZ 长期作用对H9C2中ROS 水平的
4
胞培养板，每孔2 mL，置于37 ℃、含有5% CO2的培养 影响，分别用 10 μmol/L LPZ 孵育细胞 12、24、48 h
箱中培养24 h，细胞给药后培养一定时间，用RIPA裂 后，采用 ROS 检测试剂盒进行检测。结果如图 1 所
解液（使用前2 min内加入蛋白酶抑制剂）冰上裂解 示，10 μmol/L LPZ 孵育细胞 48 h，ROS 荧光强度与
细胞 15 min，刮取的细胞裂解液用细胞破碎仪冰上 对照组相比差异有统计学意义，LPZ 可以时间依赖
超声 3~5 次，每次 5 s，然后离心取上清。根据 BCA 性地诱导氧化应激。
试剂盒操作说明测定蛋白浓度，调齐浓度后加入5× 2.2 LPZ时间依赖性地诱导内质网应激，增加凋亡
蛋白上样缓冲液煮沸 10 min，变性后的蛋白样本立 相关蛋白的表达
即使用或保存于-80 ℃冰箱。使用 10%或 12%的 为了研究 LPZ 对 H9C2 细胞内质网应激和凋亡
SDS⁃PAGE分离胶，按照每孔35 μg的上样量进行电 相关蛋白表达的影响，分别用LPZ孵育细胞12、24、
泳，待蛋白分离后停止电泳。用湿转法转移至 48 h后，用Western blot进行检测。结果显示，LPZ可
PVDF膜上，室温条件下用5%脱脂牛奶封闭90 min， 以时间依赖性地增加H9C2中内质网应激相关蛋白
经TBST漂洗后放入相应的一抗中，4 ℃孵育过夜。次 GRP78 和 CHOP 的表达，且在 48 h 时最为明显（图
日取出条带，用TBST缓冲液漂洗3次，每次10 min。 2）。Caspase⁃12 和 Caspase⁃3 的激活在内质网应激
室温条件下在摇床上孵育二抗约 1 h，结束后仍用 诱导的细胞凋亡中起关键作用。LPZ时间依赖性地
TBST 缓冲液漂洗 3 次，最后使用 Tanon 显色系统进 增加 Cleaved⁃Caspase⁃12 和 Cleaved⁃Caspase⁃3 蛋白
A
0 h 12 h 24 h 48 h
B
2.0 *
1.5
荧光强度 1.0
0.5
0
0 h 12 h 24 h 48 h
A：荧光显微镜下观察LPZ孵育细胞不同时间的荧光强度；B：ROS荧光强度的统计图。两组比较，P < 0.05，n=3。
*
图1 LPZ对H9C2细胞氧化应激的影响
Figure 1 The effects of LPZ on oxidative stress in H9C2 cells
