Page 49 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第7期 李美双，赵丽华，李荣凤. 猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备［J］.
2022年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：941-947 ·945 ·

1 250 500 750 1 000 1 250 1 324

特异位点
人
超家族

特异位点
猪
超家族

特异位点
鼠
超家族

图3 人、猪、鼠SALL1蛋白结构域对比
Figure 3 Comparison of human，pig and mouse SALL1 protein domains

Marker Sall1 Blank
选取 Sall1 基因第 1 外显子作为 CRISPR/Cas9
2 000 bp
作用靶点设计 sgRNA（图 5），并在其两端加上可与
BbsⅠ酶切位点相连接的黏性末端合成相应的Oligo
1 000 bp
（Sall1 ⁃ sgRNA ⁃ F：5′ ⁃ CACCGAACCTCTCTACCT⁃
750 bp -751 bp
CAACTCG⁃3′；Sall1⁃sgRNA⁃R：5′⁃AAACCGAGTT⁃
500 bp
GAGGTAGAGAGGTTC⁃3′），将使用 BbsⅠ酶切后的
PX330质粒与退火后的Oligo连接，转化入大肠杆菌
250 bp 感受态后挑取单克隆菌落送至公司测序。测序结
图4 Sall1基因PCR扩增产物凝胶电泳 果证明PX330成功与sgRNA连接（图6）。
Figure 4 The results of PCR amplification products of Sall1

Sall1 genome E1 E2 E3 E4

5′ ⁃C AGGT C C C C GAGT T GAGGT AGAGAGGT T GT GAT C GC ⁃ 3′
sgRNA sequence
3′ ⁃GT C C AGGGGC T C AAC T C C AT C T C T C C AAC AC T AGC G⁃ 3′
PAM Target
图5 Sall1基因sgRNA靶点设计模式图
Figure 5 The pattern diagram of Sall1 gene knockout

图6 重组载体测序验证
Figure 6 Verification of recombinant vector via sequencing

2.3 Sall1基因CRISPR/Cas9打靶载体效率验证 提取细胞基因组。使用 PCR 扩增其基因组后送至
将重组打靶载体 PX330⁃sgRNA 转染至 PFF 后， 生物公司测序，测序结果表明PX330⁃sgRNA的打靶