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第42卷第7期
               ·942 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年7月


                  肾脏疾病是最常见的疾病之一，全球约有                            2017 年 Wu 等  ［16］ 提出人类干细胞经囊胚互补可移
              8.5 亿患者饱受急性或慢性肾衰竭的折磨 。目前                          植并分化为猪胚胎中的多个谱系。2020年Das等                    ［17］
                                                    ［1］
              由于透析设备以及肾脏供体的短缺，每年约有 5 万                          将人诱导多能干细胞注射入ETV 猪囊胚中，其后代
                                                                                             -/-
              人死于肾衰竭 。肾脏透析疗法虽然可以代替肾脏                            的血管内皮细胞均来源于人类细胞。因此，本研究
                          ［2］
              完成排泄功能，但是并不能代替肾脏行使内分泌功                            认为通过CRISPR/Cas9基因编辑技术获得肾脏器官
              能。肾脏移植虽然在一定程度上恢复肾脏功能，但                            发育缺陷的猪模型，并将其与囊胚互补技术结合，或
              也由于器官供应的短缺和免疫抑制药物的相关问                             许可以实现在猪体内再生人的肾脏器官。
              题而受到阻碍，因此开发新的低免疫原性的器官具                                 Spalt 样 转 录 因 子 1（spalt like transcription
              有较大的应用前景。利用患者来源的干细胞通过                             factor1，SALL1）在肾脏发生过程中极为重要。Sall1
              囊胚互补技术，有望在大动物体内再生人源化的肾                            基因主要表达于输尿管芽周围的生后肾原基内，参
              脏器官。囊胚互补首先利用基因编辑技术在胚胎                             与诱导输尿管芽反复分支形成输尿管、肾盂、肾盏和
              发育早期阶段敲除决定某个器官发育的关键基因，                            集合小管的肾脏发育过程。2001 年 Nishinakamura
              然后待胚胎发育到囊胚阶段后将多能干细胞注入                             等 ［18］ 研究发现 Sall1 基因的纯合缺失小鼠在出生后
              到囊胚腔内，干细胞将参入胚胎形成嵌合体，并优                            24 h 内死亡，表现出肾发育不全或严重发育不良。
              先去形成由于关键基因敲除导致的缺失的器官。                             2019 年 Goto 等 ［19］ 利用囊胚互补技术将大鼠胚胎干
                     ［4］
              Chen 等 将正常小鼠胚胎干细胞注射到来自 rag⁃2                      细胞注射到 Sall1 敲除小鼠囊胚内，嵌合体比例为
              缺陷小鼠的囊胚中，获得了其成熟 B 细胞和 T 细                         69.1%，这提示通过敲除猪 Sall1 基因获得肾脏发育
              胞均来源于供体干细胞的嵌合小鼠。此后，研究者                            空位，从而进行人猪异种囊胚互补的可能性。
                                                         ［6］
              们对囊胚互补的研究逐渐深入，胸腺 、甲状腺 、                                关于猪肾脏发育不良模型，虽然Watanabe等                ［20］
                                               ［5］
              肺 ［6- 7］ 等脏器的种内囊胚互补均已出现。2010 年                    进行了研究，但其获得的动物模型依然存在一定的
                         ［8］
              Kobayashi 等 利用囊胚互补技术在小鼠体内生成                       局限性，目前为止尚未见到肾脏完全缺失的猪模型
              大鼠胰腺，论证了利用囊胚互补进行异种器官生成                            的报道。本研究通过对人、猪、鼠 SALL1 蛋白的同
              的可行性。这提示研究者去探索在人类以外的物                             源性进行分析，进一步验证了猪与人SALL1蛋白的
              种中产生具有功能的人类器官。考虑到在解剖学、                            相似性，同时通过 CRISPR/Cas9 基因编辑技术对巴
              生理学等方面与人类的相似之处，猪被人认为是再                            马小型猪胎儿成纤维细胞进行Sall1基因敲除，为获
              生人源性器官的合适载体 。                                     得肾缺失猪模型以及研究 Sall1 基因在猪肾脏发育
                                     ［9］
                  CRISPR 即规律间隔成簇短回文重复序列，最                       过程中的作用提供研究材料，并为下一步获得肾缺
              早于1987年由Ishino在大肠杆菌中发现。研究者们                       失模型以及进行人源性干细胞囊胚互补奠定基础。
              将 CRISPR 与Ⅱ型 CAS 蛋白相结合，使其迅速成为                     1 材料和方法
              应用最广泛的基因编辑工具              ［10］ 。体细胞核移植与
              CRISPR/Cas9 的联合应用已广泛用于大动物基因                       1.1  材料
              编辑模型的构建         ［11］ 。例如，2017 年 Zhang 等  ［12］ 将        35 d 猪胎儿成纤维细胞由本实验室制备并培
              C3 基因敲除，产生了血浆中C3蛋白缺乏的猪模型；                         养 。 DMEM 培 养 液 、DPBS、0.25% Trypsin ⁃ EDTA、
              2020年Fischer等  ［13］ 获得了GGTA1/CMAH/B4GALNT2        G418 和 Penn/Strep solution（Gibco 公司，美国），胎牛
              三基因敲除的猪模型用于异种免疫排斥的研究。                             血清（Sigma 公司，美国），PX330 骨架质粒（Addgene
              这说明结合体细胞核移植技术与 CRISPR/Cas9 技                      公司，美国），BbsⅠ核酸内切酶、Quick Ligase连接酶
              术获得肾脏发育缺陷猪模型的可能性。2013 年                           （New England Biolabs 公 司 ，美 国）；FastPure Gel
                        ［14］
              Matsunari等 首先获得了Pdx1 胰腺发育缺陷的猪                     DNA Extraction mini Kit（南京Vazyme 公司），无内毒
                                          -/-
              模型，随后他们将带有荧光标记的另一品系的猪胚                            素质粒大提试剂盒（北京 TIANGEN 公司），P3 细胞
              胎卵裂球注入 Pdx1 囊胚中，获得了来源于荧光标                         核转染试剂盒（Lonza 公司，德国），DH5α感受态、
                                -/-
              记细胞的具有正常组织特征及功能的外源胰腺。                             pMD 18T载体（TaKaRa公司，日本）。
              2020年Matsunari 等 ［15］ 又在HHEX 肝脏缺陷的猪模              1.2  方法
                                            -/-
              型中通过种内囊胚互补获得了肝脏发育正常的猪胎                            1.2.1  人、猪、鼠SALL1蛋白的生物信息学分析
              儿，这证明了猪进行种内囊胚互补的可能性。此外，                                下 载 NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/）
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