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第42卷第7期
               ·946 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年7月


              效率为51.6%。                                         33 个单克隆细胞系。TA 克隆测定具体序列，共获
              2.4  Sall1基因敲除细胞系的制备及鉴定                           得 23 个 Sall1 基 因 敲 除 的 细 胞 系 ，敲 除 效 率 为
                  将 PX330⁃sgRNA 打靶载体与 Td⁃tomato（G418            69.7%。其中 Sall1 双等位基因敲除的细胞系 16 个
              抗性）质粒共同转染原代 PFF 后，经 G418 药筛获得                     （主要敲除形式见表1），敲除效率为48.5%。

                                                表1 Sall1 细胞系的主要敲除形式
                                                         -/-
                                         Table 1 The knocking⁃out modalities of Sall1 cell line
                                                                            -/-
                  编号                                     序列                                        类型
                   WT            GGTCCC CGAGTTGAGGTAGAGAGGTT GTGATCGCTGA                            WT
                    1            GGTCCCCGAGGTTGAGGTAGAGAGGTTGTGATCGCTGA                            +1 bp
                    2            G G T C C C C----- G A G G T A G A G A G G T T G T G A T C G C T G A  -5 bp
                    3            G G T--------------A G A G A G G T T G T G A T C G C T G A     -14 bp/+1 bp
                                 GGTCCCCGAGGTTGAGGTAGAGAGGTTGTGATCGCTGA
                    4            G G T C C---- G T T G A G G T A G A G A G G T T G T G A T C G C T G A  -4 bp
                    5            GGTCCCCGAGGTTGAGGTAGAGAGGTTGTGATCGCTGA                            +1 bp
                    6            G G T C C C C----------- G A G A G G T T G T G A T C G C T G A    -11 bp
                 WT：野生型；加框为增加的碱基；-为删除。


                                                                途 也 主 要 局 限 于 小 鼠 模 型 的 开 发       ［24］ 。 2013 年
              3 讨    论
                                                                CRISPR/Cas9基因编辑系统的问世极大地促进了大
                  哺乳动物胚胎肾脏发生十分复杂，可分为前                           动物基因编辑模型的发展。本课题组在前期研究
              肾、中肾、后肾3个阶段。前肾和中肾在肾脏发生过                           中已成功构建多种基因敲除的猪模型，如 C3 、
                                                                                                            -/-
              程中逐渐退化，后肾最终发育为永久肾。胎儿发育                            Six1 和 Six1 /Six4 等基因敲除克隆猪           ［12，25］ ，这验
                                                                    -/-
                                                                            -/-
                                                                                  -/-
              晚期输尿管芽侵入后肾间质，随后这两种组织相互                            证了CRISPR/Cas9在大动物基因编辑模型构建中的
              诱导共同分化促使后肾的发生。研究已发现许多                             可行性与便捷性。本研究首先通过测序检测用于
              对后肾发生至关重要的基因，主要包括 Sall1、Six1、                     基因编辑的Sall1⁃PX330⁃sgRNA 打靶载体的敲除效
              Gdnf、Six4、Eya1等。SALL1蛋白在S形体、逗号形小                  率，随后将其与G418抗性的质粒共同转染入猪PFF
              体、肾小管和足细胞等间充质衍生结构中大量表                             细胞系中。通过药物筛选共获得 33 个单克隆细胞
              达。研究表明人类 Sall1 基因突变将会导致一种与                        系，经过多重鉴定后发现共有 23 个 Sall1 单等位基
              多器官发育缺陷相关的常染色体显性遗传病，即                             因和双等位基因敲除的细胞系，其敲除效率高达
              Townes⁃Brocks 综合征，其可表现为肾发育不全或肾                    69.7%，而其中双等位基因敲除的细胞系有16个，其
              缺陷  ［21］ 。Sall1 基因敲除的纯合子小鼠表现出输尿                   敲除效率为 48.5%。本研究结果显示利用 CRISPR/
              管芽生长及分支受损          ［22］ ，这说明Sall1基因对后肾发           Cas9 技术制备 Sall1 基因敲除的猪 PFF 细胞系具有
              育中输尿管芽的侵袭作用至关重要。                                  高效性与可实施性。
                  与啮齿类动物相比，猪的组织形态与生理和人                               综上所述，本研究利用生物信息学方法验证了
              更为相似    ［23］ 。同时，与非人灵长类动物相比，猪具                    人与猪 SALL1 蛋白较高的同源性。同时构建了可
              有广泛的可用性、优良的育种潜力和较短的生殖成                            用于Sall1基因敲除的CRISPR/Cas9打靶载体，并成
              熟期  ［23］ 。本研究利用生物信息技术分析人、猪、鼠                      功获得了Sall1双等位基因敲除的细胞系，这些细胞
              SALL1蛋白的氨基酸序列、二级结构、三级结构和保                         系可为构建猪肾脏缺失模型提供供体细胞，为探究
              守结构域，发现猪SALL1蛋白与人SALL1蛋白具有                        Sall1 基因在猪肾脏发育过程中的作用提供前期基
              高度同源性。由此本文认为，制备Sall1基因敲除的                         础，并为在异种动物体内再生人源化肾脏提供理论
              猪PFF细胞系，以获得肾脏缺失的猪模型，使下一步                          依据。
              通过猪 Sall1 基因敲除囊胚和人干细胞互补在猪体
              内再生人源化肾脏成为可能。                                     ［参考文献］
                  早期传统的基因敲除方法基于同源重组，其用                          ［1］ JAGER K J，KOVESDY C，LANGHAM R，et al. A single
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