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第42卷第7期             李美双，赵丽华，李荣凤. 猪SALL1蛋白分子信息分析及基因敲除细胞系制备［J］.
                  2022年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：941-947                        ·943 ·


                中所提供的人、猪、鼠SALL1蛋白的氨基酸序列，使                         说明书，利用程序EN150，将5 μg Sall1⁃PX330⁃sgRNA
                用 DNAMAN 软件比对分析人与猪 SALL1 氨基酸的                     质粒转入细胞中。培养 48 h 后提取细胞基因组。
                相似度及人与鼠SALL1氨基酸的相似度；使用在线                          PCR 扩增打靶区域后进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回
                网站 SOPMA（https：//npsa⁃prabi.ibcp.fr/）比对分析         收纯化DNA，并用测序分析方法检测sgRNA的打靶
                人、猪、鼠 SALL1 蛋白的二级结构，预测其α螺旋、                       效率。首先，PCR 扩增打靶区域基因组后送至南京
                β折叠、β转角和无规卷曲的比例；使用在线网站                            思普金生物科技有限公司测序，PCR 引物和反应条
                SWISS MODEL（https：//www.swissmodel.expasy.org/）   件同 1.2.2。然后，以野生型细胞的测序结果为对
                预测人、猪、鼠 SALL1 蛋白的三级结构，再使用                         照，利用在线分析软件（https：//tider.deskgen.com/）分
                PyMOL 软件比较人与猪及人与鼠 SALL1 蛋白三维                      析打靶载体的效率。
                结构的相似度；使用NCBI中CD⁃search工具比对人、                     1.2.4  细胞转染和单克隆细胞的筛选鉴定
                猪、鼠SALL1蛋白的保守结构域。                                     使用 DMEM 培养基（含 15%胎牛血清）于 6 cm
                1.2.2  sgRNA的设计与CRISPR/Cas9载体构建                   培养皿中培养原代 PFF 细胞，待细胞融合度达到

                    根据 NCBI 中所提供的猪 Sall1 基因序列（Gene                90%左右时，0.05%胰蛋白酶消化并收集细胞。将
                ID：100519899），在第1外显子两端设计可用于扩增                     8 μg 的 Sall1⁃PX330⁃sgRNA 打 靶 载 体 与 1 μg 的
                Sall1 基因的 PCR 引物并送至南京金斯瑞生物公                       Td⁃tomato（G418抗性）质粒混匀后按照P3细胞核转

                司合成。以巴马小型猪胎儿成纤维细胞（porcine                         染试剂盒，使用程序EN150进行核转染。转染完成
                fetal fibroblast，PFF）基因组 DNA 为 PCR 模板，反应          后将细胞平均分至30个10 cm培养皿中培养。24 h
                条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，    后将培养液换为含有浓度为 1 mg/mL 的 G418 培养
                35 个循环；72 ℃ 7 min。通过琼脂糖凝胶电泳获得                     基进行药物筛选，每3 d更换1次液体。
                单一条带后将产物送至生物公司测序，确定巴马小                                药筛至未转染阴性对照组细胞全部死亡时，将
                型猪中 Sall1 基因的具体序列。根据测序获得的                         G418 浓度调整至 500 μg/mL，继续培养 7~10 d 至单
                Sall1 基因序列，利用 CRISPR 在线设计网站（http：//               克隆细胞形成。用克隆环挑取状态较好的单克隆
                crispor.tefor.net/），遵循靶点设计原则（5′端为 G，              细胞至24孔板中，待细胞长满后留取30%于原培养
                3′端为PAM序列，即NGG）选择合适的靶点位置，设                        板提基因组，70%传代至 6 孔板中至细胞长满后冻
                计长度为20 bp的sgRNA 序列并在5′端进行磷酸化                      存备用。
                修饰。                                                   使用细胞裂解液NP40裂解细胞提取基因组DNA
                    CRISPR/Cas9 载体构建由 PX330 载体线性化、                并进行 PCR 扩增，裂解反应条件为：55 ℃ 60 min，
                引物退火、PX330 线性化载体与退火引物连接等步                         95 ℃ 10 min。PCR 产物测序后比对序列，选择突
                骤组成。首先使用 BbsⅠ核酸内切酶酶切 PX330 质                      变的细胞基因组经 PCR 扩增和琼脂糖凝胶纯化。
                粒使其线性化，同时将合成的5′磷酸化的sgRNA 序                        将纯化的基因组 DNA 与 pMD18⁃T 载体连接后转化
                列于 37 ℃孵育 30 min，95 ℃孵育 5 min，然后将其                至大肠杆菌感受态中，每板挑选 12 个菌落进行测
                以 5 ℃/min 的速率将温度降至 25 ℃。再使用 Quick                 序。测序结果与野生型比对后确定 Sall1 基因敲除
                Ligase连接酶将已线性化的PX330质粒与退火引物                       细胞系。
                连接，反应条件为25 ℃连接10 min。最后将连接产
                                                                  2 结    果
                物转化至大肠杆菌感受态 DH5α中，挑取单菌落保
                存并送测序公司检测 sgRNA 是否成功连入 PX330                      2.1  人、猪、鼠 SALL1 氨基酸序列及蛋白结构比对
                质粒，测序引物为：5′⁃ACTATCATATGCTTACCGTA⁃                 结果
                AC⁃3′。经测序分析后选择连接成功的菌液使用大                              使用 DNAMAN 进行氨基酸比对发现：人与猪
                提质粒试剂盒提取质粒。                                       SALL1氨基酸的相似度为92.46%，人与鼠SALL1氨
                1.2.3  Sall1基因PX330⁃sgRNA载体打靶效率验证                 基酸的相似度为90.19%。使用SOPMA在线网站进

                    使用 DMEM 培养基（含 15%胎牛血清）于 6 cm                  行二级结构比对发现：人 SALL1 蛋白的α螺旋占比
                培养皿中培养原代 PFF 细胞，待细胞融合度达到                          为 23.79% ，β 转 角 占 比 为 4.53% ，拓 展 链 占 比 为
                90%左右时，0.05%胰蛋白酶消化并收集细胞。细胞                        13.44%，无规卷曲占比为58.23%；猪SALL1蛋白的α
                计数后取 1×10 个细胞，按照 P3 细胞核转染试剂盒                      螺旋占比为23.23%，β转角占比为4.30%，拓展链占
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