Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第7期
·904 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年7月

the shControl group，the volume and weight of transplanted tumors in the shPLOD2 group under oxaliplatin treatment were significantly
decreased. The mRNA and protein expressions of chemoresistance⁃related gene BCRP and MRP1 decreased after interference with
PLOD2 expression. However，the mRNA and protein expressions of chemoresistance⁃related gene BCRP and MRP1 increased after
PLOD2 overexpression. Conclusion：The study suggests that PLOD2 can intensify the oxaliplatin chemoresistance of ovarian cancer，
which may be related to the upregulation of BCRP and MRP1 expression.
［Key words］ PLOD2；ovarian cancer；chemoresistance；oxaliplatin；BCRP；MRP1
［J Nanjing Med Univ，2022，42（06）：903⁃912，1000］

卵巢癌在全球女性恶性肿瘤中，发病率和病死 司）；鼠抗人 PLOD2 单克隆抗体（Proteintech 生物公
率分居第7位和第8位，5年生存率低于45%。在中 司，美国）；鼠抗人 PLOD2 单克隆抗体（R&D 生物公
国女性生殖系统恶性肿瘤中卵巢癌的发病率和病 司，美国）；兔抗人 MRP1 多克隆抗体、兔抗人 BCRP
死率分别居第 3 位和第 1 位，每年的新发病例为 多克隆抗体（沈阳万类生物公司）；HRP 标记的兔
52 100 例，死亡达 22 500 例。手术联合铂类化疗作 抗小鼠 IgG 抗体、HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体
为一线治疗方案，很大程度上缓解了患者病情，但 （Abcam 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒（同仁公司，日
仍有高达 70%的病例会复发 ［1-2］ 。卵巢癌复发与耐 本）；细胞/组织总 RNA 提取试剂盒、High⁃Capacity
药性的产生密切相关，深入探讨卵巢癌耐药的发生 cDNA 逆转录试剂盒、SYBR 荧光定量 PCR 试剂盒
机制，提高化疗的敏感性，对于改善卵巢癌患者的 （南京诺唯赞生物公司）；Annexin V⁃kFluor647/PI 双
预后具有重要意义。 染细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）。
赖氨酸羟基化酶 2（procollagenlysine 2⁃xogluta⁃ 1.2 方法
rate 5⁃dioxygenase 2，PLOD2）是 PLOD 家族的一员， 1.2.1 细胞培养
由PLOD2基因编码，是胶原交联形成过程中的关键 按照10%胎牛血清和1%双抗的比例配制RPMI
酶 。PLOD2 可促进多种肿瘤的侵袭进展，包括乳 1640、DMEM 完全培养基，卵巢癌细胞株 A2780、
［3］
腺癌、肝癌、非小细胞肺癌等 ［4-6］ 。铂类药物常作为 OV1063、PEO4、HO8910 和 SKOV3 培 养 于 RPMI
卵巢癌一线化疗的首选药物，其中奥沙利铂作为第 1640 完全培养基，293T 细胞培养于 DMEM 完全培
三代铂类化疗药，被广泛应用于卵巢癌治疗，但容 养基，置于 37 ℃和 5% CO2 的恒温生物培养箱中。
易产生获得性耐药。PLOD2 表达与多种肿瘤的预 每 2 d换液，待细胞融合度达90%，进行胰酶消化及
后不良有关，但PLOD2对卵巢癌化疗耐药的影响及 传代培养。
分子机制尚不清楚。本研究拟采用干扰或过表达 1.2.2 PLOD2低表达细胞株和高表达细胞株的鉴定
PLOD2的方法，观察PLOD2对卵巢癌奥沙利铂化疗 培 养 卵 巢 癌 细 胞 OV1063、HO8910、SKOV3、
耐药的影响，初步探讨其分子机制，为卵巢癌临床 PEO4、A2780，待其处于对数生长期，根据细胞量用
化疗耐药的研究及逆转提供理论基础。 RIPA裂解液提取细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白
浓度，按照 1∶4 的比例加入 5×上样缓冲液，95 ℃煮
1 材料和方法
沸 10 min，分装后存放于-20 ℃。取等量蛋白质，
1.1 材料 用 SDS⁃PAGE 法分离后转至 PVDF 膜，5%的脱脂
人 卵 巢 癌 细 胞 株 A2780、OV1063、PEO4、 奶粉溶液封闭后孵育鼠抗人 PLOD2 单克隆抗体
HO8910、SKOV3，工具细胞 293T 由本实验室保存。 （1∶1 000）、鼠抗人 GAPDH 单克隆抗体（1∶1 000），
RPMI 1640 培养基、DMEM 培养基、100×青霉素/链 4 ℃过夜；次日孵育 HRP 标记的兔抗小鼠 IgG 抗体

霉素双抗、胎牛血清（Gibco公司，美国）；pPLK/GFP+ （1∶10 000），滴加 ECL 发光液后曝光。ImageJ 进行
Puro⁃PLOD2 shRNA和pLenti⁃CMV⁃PLOD2⁃Flag⁃GFP⁃ 蛋白定量分析。实验重复3次。
Puro 质粒（南京晶百生物公司）；Lenti⁃Pac 慢病毒 1.2.3 PLOD2干扰和过表达质粒的构建及鉴定
包装试剂盒（GeneCopoeia 公司，美国）；嘌呤霉素 PLOD2干扰和过表达质粒及空载体质粒均由晶
（Sigma 公司，美国）；RIPA 裂解液、BCA 蛋白定量检 百生物公司合成，其中干扰质粒目标基因长度为
测试剂盒、蛋白上样缓冲液（南京碧云天生物公 61 bp（Gene ID：852；Accessions：NM_000435），PLOD2