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第42卷第7期 边苏苏，陈玉凤，张雯晴，等. PLOD2对卵巢癌奥沙利铂化疗耐药的影响及机制研究［J］.
2022年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：903-912，1000 ·905 ·
shRNA序列为5′⁃CCAGTTACACTGAAGGTCTTT⁃3′； 5′⁃TTGACCAAGGACCTTCACAGT⁃3′；18S 上游引物
过表达质粒目标基因长度为 2 238 bp（Gene ID： 5′ ⁃ AACCCGTTGAACCCCATT ⁃ 3′ ，下 游 引 物 5′ ⁃
5352；Accessions：NM_000935）。DH5α感受态细胞 CCATCCAATCGGTAGTAGCG⁃3′。PCR 扩增条件：
进行质粒转化，均匀涂抹菌液于含氨苄青霉素 95 ℃ 30 s 预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环；
（ampicillin，AMP）的 LB 平板，倒置平放 12~16 h， 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。反应结束后检
进行单克隆挑选，并放置于 LB 液体培养基，37 ℃ 测目的基因和相应内参 18S 的 CT值，基因表达的相
摇床 200 r/min，12~16 h，可见菌液浑浊，保存菌液 对定量值以2 -ΔΔCT 计算。
于-80 ℃。取少量送南京金斯瑞公司进行测序，以 1.2.6.2 免疫印迹试验（Western blot）
验证 PLOD2 干扰序列克隆入 pPLK/GFP+Puro 载体 取 shPLOD2 组 、shControl 组 、OEPLOD2 组 、
和 PLOD2 过表达序列克隆入 pLenti⁃CMV⁃GFP⁃Puro OEControl 组对数生长期细胞，提取蛋白、测定蛋白
载体。 浓度、进行 Western blot 并计算灰度值与 1.2.2 方法
1.2.4 慢病毒包装及滴度测定 相同。
10 cm 培养皿培养 293T 细胞，待融合度达 80% 1.2.7 CCK⁃8实验
左右，用三质粒包装系统按照Lenti⁃Pac 慢病毒包装 胰酶消化各组对数生长期细胞后，以 5 000 个/
试剂说明书进行慢病毒包装。6~8 h 换液，48 h 和 孔细胞铺于96孔板，每孔含100 μL RPMI 1640完全
72 h 各收 1 次病毒，混合后 2 000 r/min，离心 10 min 培养基，每组3个复孔。过夜后，设定奥沙利铂浓度
去除细胞碎片，并用 0.45 μm 滤器过滤。慢病毒浓 依次为 0、0.25、0.50、1.00、2.00、4.00 μmol/L，继续培
缩液浓缩 4 ℃过夜。次日，5 000 r/min 离心 40 min， 养48 h后，吸弃旧培养基，后加入每孔10 μL CCK⁃8
离心机提前 4 ℃预冷。小心吸弃上清，用 RPMI 和 90 μL 培养基，同时设定不含细胞只含 CCK⁃8 的
1640 进行重悬得慢病毒。1×10 个/孔 293T 细胞铺 空白对照孔，37 ℃和 5% CO2的恒温生物培养箱培
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于 96 孔板，设定 10 个孔，第 1 个是空白对照，从第 养 2 h，用 Multiskan Spectrum 酶标仪测定 450 nm 波
2 个孔开始，慢病毒 1∶10 倍比稀释，培养 48 h 根据 长处的吸光度。该实验重复3次。细胞抑制率=［1-
293T细胞的荧光率计算慢病毒滴度。 （加药组-空白组）/（未加药组-空白组）］×100%。
1.2.5 病毒感染及稳定株筛选 1.2.8 克隆形成实验
将 A2780 细胞株和 OV1063 细胞株分别接种于 取对数生长期的各组细胞，按照500个/孔的浓
6 孔板，次日按照病毒感染复数 MOI40 和 MOI30 进 度种植于6孔板，贴壁后用奥沙利铂 1.25 μmol/L药
行慢病毒感染，感染含干扰质粒和过表达质粒的慢 物处理，继续培养14 d。用4%多聚甲醛固定30 min
病毒的细胞分别标记为shPLOD2和OEPLOD2，感染 后，用结晶紫染色20 min。进行拍照并统计，该实验
空 载 体 慢 病 毒 的 细 胞 分 别 标 记 为 shControl 和 重复3次。
OEControl，并添加polybrene增强感染效率。48 h观 1.2.9 流式细胞术检测细胞凋亡
察荧光并进行嘌呤霉素筛选。同时设立空白对照 取对数生长期的各组细胞，以 4×10 个/孔接
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组，待空白对照组细胞全部死亡，并且转染病毒组 种于 6 孔板，待过夜贴壁后加入 1.25 μmol/L 奥沙
细胞呈现簇状生长，进行半量维持筛选2周。 利铂，对照组加入等量PBS作为对照。48 h后，收集
1.2.6 检测PLOD2表达变化 旧培养基，用不含EDTA的胰酶消化细胞，终止消化，
1.2.6.1 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR） 1 000 r/min离心5 min后，用PBS重悬细胞并2 000 r/min
待细胞进入对数生长期，根据细胞/组织总 离心5 min，重复1次。加入Annexin V⁃kFluor647/PI
RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，再根据 High⁃ 双染细胞凋亡检测试剂，4 ℃避光 15 min，用 BD
Capacity cDNA 逆转录试剂盒说明书逆转录总 RNA FACS Aria ⅡSORP 分选型流式细胞仪和 Beckman
为cDNA。最后根据SYBR荧光定量PCR试剂盒说明 Coulter CytoFLEX 流式细胞仪进行细胞凋亡率测
书进行荧光定量扩增。反应体系为：Premix 10 μL， 定。该实验重复3次。
PLOD2 或 18S 上下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL， 1.2.10 裸鼠皮下成瘤实验
cDNA模板2 μL，去离子水7.2 μL。每个样品3个复 取 4~6 周龄雌性 BALB/c⁃NULL 裸鼠 30 只，购
孔，该实验重复3次。相关引物序列：PLOD2上游引 自南京医科大学实验动物中心，饲养于 SPF 级动
物 5′⁃CTCGAGCATCCCCACAGATAA⁃3′，下游引物 物房屏障系统的洁净层流架内，保持相对湿度
