Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第7期
·906 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年7月
40%~60%，温度（25±1）℃，生长所需的垫料、饲料和 液后曝光。ImageJ 进行蛋白定量分析。实验重复
饮水均经灭菌处理，自由进食和饮水，每日保持10 h 3 次。
的光照，14 h 无光的明暗周期，实验前适应性饲 1.3 统计学方法
养 1周。所开展的动物实验均通过南京医科大学实 用Graphpad Prism 7.0进行统计学分析，计量资
验动物福利伦理委员会批准（批准编号为 IACUC⁃ 料以均值±标准差（x ± s）表示，两组比较采用t检验，
2106029）。收集 shPLOD2 和 shControl 的对数生长 多组间比较采用单因素方差分析，用 Tukey 法进行
期细胞，80%左右密度用胰酶进行消化，RPMI 1640 两两比较检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
培养基调整细胞密度为 1×10 个/mL 的细胞悬液。
8
2 结 果
细胞悬液 100 μL/只注射到裸鼠皮下，7 d 成瘤，舍
弃未成瘤和瘤体直径超过 1 cm 的裸鼠。shPLOD2 2.1 PLOD2在不同卵巢癌细胞中的表达
组和 shControl 组再分为奥沙利铂处理组和 PBS 对 提 取 不 同 卵 巢 癌 细 胞 OV1063、HO8910、
照组，每组 6 只。奥沙利铂处理组每周 1 次腹膜内 SKOV3、PEO4、A2780 中的总蛋白，进行 Westerrn
注射奥沙利铂（10 mg/kg），对照组则注射等量 PBS blot实验。结果表明，PLOD2在OV1063细胞中相对
溶液。每 3 d 用游标尺测量肿瘤大小并记录，肿瘤 低表达，在 A2780 细胞中相对高表达（图 1）。选择
［7］
体积=长径×短径 /2 。1个月后，处死裸鼠，分离裸 OV1063 为 PLOD2 低表达细胞株，A2780 为 PLOD2
2
鼠皮下的瘤体，并进行称重。 高表达细胞株进行后续实验。
1.2.11 检测BCRP和MRP1的表达变化
1.2.11.1 qRT⁃PCR检测BCRP和MRP1 mRNA变化 A
待细胞进入对数生长期，根据细胞/组织总 OV1063 HO8910 SKOV3 PEO4 A2780
RNA 提取试剂盒提取细胞总 RNA，再根据 High⁃ PLOD2
85 kDa
Capacity cDNA 逆 转 录 试 剂 盒 说 明 书 逆 转 录 总
RNA 为 cDNA。最后根据 SYBR 荧光定量 PCR 试 GAPDH
37 kDa
剂盒说明书进行荧光定量扩增。反应体系为：
Premix 10 μL，上下游引物（10 μmol/L）各 0.4 μL，
B
cDNA模板2 μL，去离子水7.2 μL。每个样品3个复
1.5
孔，该实验重复 3 次。相关引物序列：BCRP 上游引
物 5′⁃CAGGTGGAGGCAAATCTTCGT⁃3′，下游引物 1.0
5′⁃ACCCTGTTAATCCGTTCGTTTT⁃3′；MRP1 上游引 PLOD2/GAPDH
物 5′⁃CTCTATCTCTCCCGACATGACC⁃3′，下游引物 0.5
5′⁃AGCAGACGATCCACAGCAAAA⁃3′；18S 上游引
0
物 5′⁃AACCCGTTGAACCCCATT⁃3′，下游引物 5′⁃ PEO4
CCATCCAATCGGTAGTAGCG⁃3′。扩增条件和计算 OV1063 HO8910 SKOV3 A2780
方法与前文相同。
A：不同卵巢癌细胞中的PLOD2表达水平；B：直方图定量分析（n=3）。
1.2.11.2 Western blot检测BCRP和MRP1的蛋白表达
图1 PLOD2在卵巢癌细胞株中的蛋白表达情况
取对数生长期细胞，根据细胞量用 RIPA 裂解 Figure 1 Protein expression of PLOD2 in ovarian cancer
液提取细胞总蛋白，BCA 试剂盒测定蛋白浓度，按 cell lines
照1∶4的比例加入5×上样缓冲液，95 ℃煮沸10 min，
分装后存放于-20 ℃。取等量蛋白质，用SDS⁃PAGE 2.2 慢病毒干扰和过表达质粒的构建及鉴定
法分离后转至 PVDF 膜，5%的脱脂奶粉溶液封闭 将针对 PLOD2 基因的干扰和过表达质粒进行
后孵育兔抗人 MRP1 多克隆抗体（1∶1 000）、兔抗 DNA 测 序 ，测 序 结 果 通 过 Blast 序 列 比 对 ，证 实
人 BCRP 多克隆抗体（1∶1 000）、鼠抗人 GAPDH shPLOD2 已正确克隆入 pPLK/GFP+Puro 载体，表明
单克隆抗体（1∶1 000），4 ℃过夜；次日孵育对应 重组shPLOD2质粒构建成功；OEPLOD2已正确克隆
的 HRP 标记的山羊抗兔 IgG 抗体（1∶10 000）和 入 pLenti⁃CMV⁃GFP⁃Puro 载体，表明 OEPLOD2 质粒
兔 抗 小 鼠 IgG 抗 体（1∶10 000），滴 加 ECL 发 光 构建成功。
