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第42卷第8期
               ·1088 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


              Conclusion：Knockdown of TSP⁃4 alleviates HG⁃induced apoptosis，oxidative stress and inflammatory response in podocytes，thus
              showing a protective effect on podocytes. Transcription factor STAT3 has positive function to the promoter activity of TSP⁃4.
             ［Key words］ podocytes；diabetic kidney disease；thrombospondin⁃4；apoptosis；inflammatory response
                                                                      ［J Nanjing Med Univ，2022，42（08）：1087⁃1092，1106］





                  糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）是          （5 ⁃ ethynyl ⁃ 2’⁃ deoxyuridine，EdU）、二 喹 啉 甲 酸
              糖尿病的一种进行性微血管并发症，由肾小球毛细                            （bicinchoninic acid，BCA）蛋 白 浓 度 测 定 试 剂 盒 、
              血管损伤引起。其病理表现为持续性蛋白尿、肾小                            Hoechst 33342试剂盒、RIPA裂解液、葡萄糖、兔抗信
                                          ［1］
              球滤过率降低、动脉血压升高等 。迄今为止，DKD                          号转导因子和转录激活因子 3（signal transducer and
              已成为糖尿病患者预期寿命缩短的主要原因。由于                            activator of transcription3，STAT3）多克隆抗体、兔抗
              糖尿病发病率的增加，DKD的年发病率在过去10年                          p⁃STAT3 多克隆抗体和抗β⁃actin 单克隆抗体等（上
              中增加了 1 倍以上。目前 DKD 约占终末期肾病                         海碧云天生物技术公司），STAT3 激动剂 Colivelin
                                                    ［2］
             （end stage renal disease，ESRD）病例的50% 。DKD          （Selleck 公司，美国），实时荧光定量聚合酶链反应
              的发病机制十分复杂，尚未明确。一般认为足细胞                            （real⁃time quantitative PCR，qRT⁃PCR）试剂盒（TaKaRa
                                                         ［3］
              损伤、减少以及蛋白尿是 DKD 的主要病理因素 。                         公司，日本），Annexin V⁃FITC（BD Biosciences 公司，
              足细胞是肾小球的先天细胞之一，从根本上充当肾                            美国），EdU溶液、酶标仪（Thermo Fisher Scientific 公
              小球滤过膜的最后一道屏障。多种原因引起的足                             司，美国），丙二醛（malondialdehyde，MDA）、超氧化
              细胞损伤使肾小球滤过膜的通透性增加，导致蛋白                            物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、过氧化氢酶
              尿，加速肾脏疾病的进展              ［4］ 。血小板反应蛋白             （catalase，CAT）使用试剂盒（南京建成生物工程研
             （thrombospondins，TSP）是一组多域糖蛋白，存在于                  究所），2’，7’⁃二氯荧光素二乙酸酯（2’，7’⁃dichloro⁃
              胚胎的细胞外基质中。它们通过与受体分子结合而                            fluorescin diacetate，DCFH⁃DA）（Sigma 公司，美国），
              负责细胞⁃细胞相互作用和细胞⁃基质相互作用 。                           电泳仪和转膜仪（北京六一公司），凝胶成像系统
                                                         ［5］
              TSP有5个家族成员，其中TSP⁃4是一种细胞外钙结                        （Bio⁃Rad 公司，美国），双荧光素酶报告系统（Pro⁃
              合蛋白，具有调节细胞迁移、增殖、黏附和组织重塑                           mega 公司，美国），高速低温离心机器（Eppendrof 公
              等多种功能 。TSP⁃4在保护心脏中发挥重要作用，                         司，德国）。
                        ［6］
              包括心肌组织重塑和心肌肥大的预防。它也是一                             1.2  方法
              种与癌症相关的调节剂。TSP⁃4可通过触发血管生                          1.2.1 细胞培养与转染
              成，可作为治疗癌症的新靶点。此外，TSP⁃4还具有                              小鼠足细胞系在RPMI164037℃培养，以30mmol/L
              调节肌腱和骨骼肌的结构和功能的作用。文献报                             葡萄糖刺激作为 HG 组，5 mmol/L 葡萄糖诱导作为
              道了TSP⁃4在加速瘢痕形成和介导局部炎症反应中                          阴性对照组。使用 Lipofectamine 2000 常规进行细
              的作用   ［7-8］ 。目前 TSP⁃4 在 DKD 中的作用机制研究              胞转染。接种在 24 孔板中的细胞生长至 30%~
              较少。本研究旨在探讨TSP⁃4在高糖（high glucose，                  50%。6 h更换新鲜培养基。48 h后，收集细胞用于
              HG）诱导的足细胞损伤中的作用及其潜在机制。                            后续实验。
                                                                1.2.2 定量逆转录聚合酶链反应
              1  材料和方法
                                                                     使用 TRIzol 收集总 RNA。使用商业试剂盒从
              1.1  材料                                           总 RNA 的逆转录中获得 cDNA，使用 SYBR Green
                  小鼠足细胞系（ATCC，美国），RPMI 1640 培养                  PCR Master Mix将其用作qRT⁃PCR的模板。95 ℃预
              基和 0.25%胰蛋白酶（HyClone 公司，美国），胎牛血                   变性 30 s，95 ℃10 s 变性，60 ℃退火 10 s，72 ℃延伸

              清（Gibco 公司，美国），TRIzol、Lipofectamine 2000          20 s循环40个循环。GAPDH为内参，相对水平采用
             （Invitrogen 公司，美国）。鼠抗 TSP⁃4 多克隆抗体                  2 -ΔΔCT 法计算。GAPDH 的序列为 5′⁃AGGTCGGTGT⁃

             （R&D 公司，美国），增强化学发光法（enhanced che⁃                  GAACGGATTTG⁃3′（正向）和5′⁃GGGGTCGTTGATG⁃
              miluminescence，ECL）试剂盒、细胞计数试剂盒（cell               GCAACA⁃3′（反向），TSP⁃4的序列为5′⁃ACCGACAG⁃
              counting kit⁃8，CCK⁃8）、5⁃乙炔基⁃2’脱氧尿嘧啶核苷             TAGAGATGGTCTTCC⁃3′（正向）和 5′⁃CGTCACAT⁃
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