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第42卷第8期         庄一波，杨     勇，宁晶晶，等. STAT3通过血小板反应蛋白4诱导足细胞凋亡及炎症反应［J］.
                  2022年8月                  南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1087-1092，1106                   ·1089 ·


                CTGAAGCCAGGAGA⁃3′（反向）。                            夜。第 2 天，蛋白质⁃DNA 复合物被洗脱和纯化，获
                1.2.3 蛋白质印迹法                                      得的DNA样品进行qRT⁃PCR。
                    细胞裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 离心15 min，         1.2.11 双荧光素酶报告基因检测
                使用BCA法测定蛋白质浓度后，制备蛋白质样品用                               将接种在 96 孔板中的细胞与含有野生型或突
                于 SDS⁃PAGE（每泳道 30 μg）并转移到 PVDF 膜上。                变型TSP⁃4启动子和STAT3的小干扰RNA（small in⁃
                在特定条件下阻断膜上的非特异性抗原后，用一抗                            terfering⁃STAT3，si⁃STAT3）/阴性 siRNA 序列（si⁃neg⁃
               ［抗 TSP⁃4（1∶2 000）、抗 STAT3（1∶2 000）和 抗              ative control，si⁃NC）的pGL3荧光素酶报告载体共转
                p⁃STAT3（1∶2 000）］和二抗（1∶5 000）。使用ECL方              染。双荧光素酶报告系统用于测量相对荧光素酶
                法检测蛋白质信号。                                         活性，以海肾荧光素酶活性作为内参。

                1.2.4  酶联免疫吸附试验（enzyme⁃linked immuno⁃             1.3  统计学方法
                sorbent assay，ELISA）                                  Western blot 图像的数据提取使用 Image Lab 软
                    收集细胞上清液，5 000 r/min、4 ℃离心 10 min。             件。使用 SPSS 22.0 进行统计分析。两组间的对比
                按照推荐使用 ELISA 试剂盒检测促炎因子的相对                         在正态性检验之后用独立样本t检验，多组间比较采
                水平。                                               用单因素方差分析。所有实验重复3次。P < 0.05为
                1.2.5 流式细胞术                                       差异有统计学意义。

                    PBS洗涤后，离心细胞并重悬。在黑暗中用10 μL
                                                                  2  结 果
                Annexin V⁃FITC 诱导细胞，然后 1 000 r/min 离心
                5 min。重悬的沉淀剂在 4 ℃避光下用 5 μL PI 进一                  2.1  HG诱导的足细胞中TSP⁃4的上调
                步诱导。使用流式细胞术在 30 min 内检查凋亡细                            检测 HG 诱导 0、24、48、72 h 的足细胞中 TSP⁃4
                胞。通过PI染色类似地检查细胞周期分布。                              的表达水平。结果表明，TSP⁃4的核酸（图 1A）和蛋
                1.2.6 CCK⁃8检测                                     白质水平（图 1B、C）均呈时间依赖性上调，在 72 h
                    细胞接种于96孔板中，接种量为3×10 个/孔。空白                    达到峰值。
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                组只填充培养基。在指定时间点，每孔加入10 μL CCK⁃                     2.2  干扰TSP⁃4抑制HG诱导的足细胞凋亡
                8溶液，培养4 h。通过酶标仪测量450 nm处的光密                           足细胞凋亡是 DKD 发展过程中的一个重要事
                度值。                                               件。我们发现在足细胞中，HG 降低了细胞活力和
                1.2.7 EdU检测                                       EdU 阳性细胞比例（图 2A~C）。有趣的是，我们应
                    将细胞以1×10 个/孔接种于24孔板中，培养过                      用 siRNA 干扰了 TSP⁃4 后，细胞活力和 EdU 阳性细
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                夜。使用EdU溶液染色，Hoechst 33342用于在黑暗                    胞显著高于对照组，表明干扰 TSP⁃4 后促进了足细
                中染色细胞核。捕获了 EdU 染色的细胞（红色）、                         胞的增殖。流式细胞术结果表明HG刺激增加了G1
                Hoechst 33342 染色的细胞核（蓝色）以及合在一起                    期的细胞凋亡率和细胞比例，但是应用 si⁃TSP 后会
                的细胞图像。                                            抑制这种情况（图 2D、E）。因此，抑制TSP⁃4的表达
                1.2.8 MDA、SOD和CAT的测量                              可以阻断HG诱导的足细胞损伤。
                    MDA、SOD和CAT的相对水平使用试剂盒按照                       2.3 干扰TSP⁃4可减轻HG诱导的足细胞氧化应激
                建议进行检测。                                               氧化应激有助于DKD的恶化。为了确定TSP⁃4
                1.2.9 活性氧（reactive oxygen species，ROS）的测量         对 HG 诱导的足细胞氧化应激的影响，我们使用
                    DCFH⁃DA 方法测量细胞内 ROS 水平。分别测                    DCF⁃DA 方法检测了细胞内 ROS 水平。结果表明
                量了 485 nm 发射波长和 530 nm 发射波长下的光                    HG 诱导 ROS 的表达，可被 si⁃TSP⁃4 逆转（图 3A）。
                密度。                                               此外，还检测了 MDA、SOD 和 CAT 的相对表达水

                1.2.10  染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipi⁃          平。HG 诱导的足细胞中 MDA 表达升高，SOD 和
                tation，ChIP）                                      CAT活性降低，与HG诱导ROS的表达变化一致，从
                    2×10 个细胞用 1%甲醇裂解，超声处理制备                       而进一步证明HG诱导了氧化应激。但它们的水平
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                200~1 000 bp 的 DNA 片段。细胞裂解物与 1 μg 抗               均可通过si⁃TSP⁃4来逆转（图 3B~D）。

                IgG 或抗 STAT3 一起孵育。然后在 4 ℃下在 20 μL                 2.4 干扰TSP⁃4抑制HG诱导的足细胞炎症反应
                蛋白 A/G 免疫沉淀磁珠中诱导染色质上清液过                               我们通过检测促炎因子的相对表达水平，进一
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