Page 52 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1094 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


              of a spectrum of cellular functions，which finalizes the destruction of synaptic structure and neuronal damage.
             ［Key words］ primary neuron；proteomics；synapse；neuronal damage
                                                                           ［J Nanjing Med Univ，2022，42（08）：1093⁃1099］





                  甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）的滥用                美国），真空离心浓缩仪（LNG⁃T98，苏州太仓华美），
              已成为包括我国在内的全球公共卫生问题。METH                           超声破碎仪（JY96⁃IIN，宁波新芝公司），MP Fastprep⁃
              滥用不仅造成机体多系统的严重损伤，同时亦对家                            24 匀浆仪（Fastprep⁃24 5G，MP 公司，美国），CO2恒

              庭及社会稳定造成极大危害。脑损伤一直是METH                           温培养箱（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；Pro⁃
              滥用引起神经损伤及精神障碍的不良后果。研究                             teome Discoverer 2.1（Thermo Fisher Scientific 公司，
              显示，METH可作用于多巴胺单胺能神经元，引起多                          美国），MASCOT 2.6（Matrix Science公司，美国），Per⁃
              巴胺大量释放，产生兴奋性毒性，导致该区域神经                            seus 1.3（Max Planck Institute of Biochemistry in Mar⁃
              元死亡，引发帕金森样改变 ；我们前期研究显示，                           tinsried，德国），R version 3.0.3。
                                       ［1］
              METH 暴露亦可引发阿尔兹海默症（Alzheimer’s                          Neurobasal medium、B27、L ⁃ 谷 氨 酰 胺 、甲 酸
              disease，AD）样病理性蛋白β⁃amyloid（Aβ）、p⁃tau 的            （Thermo Fisher Scientific 公司，美国），DMEM/F12、
                      ［2］
              显著上调 ；此外，METH 暴露引发精神性疾病，如                         胎牛血清（Gibco 公司，美国），Alexa Fluor⁃568（Life
                         ［3］
              抑郁、焦虑等 。然而，在目前的多数报道中，METH                         公司，美国），BSA、Tris（北京生工公司），木瓜蛋白
              的神经毒性及其机制的研究往往集中于某种病理                             酶、碘乙酰胺、NH3·H2O、NH4HCO3 （Sigma Aldich 公
              性改变或某种机制的探讨，对 METH 暴露引发的病                         司，美国），乙腈（Merck 公司，美国），BCA 定量试剂
              理性改变仍缺乏系统而全面的认识。基于此，借助                            盒、SDS⁃PAGE 蛋白上样缓冲液（杭州碧云天），甲基
              于高通量的蛋白组学，本研究探讨了原代神经元                             苯丙胺（北京中国食品药品检定研究院），Multiple
              METH 暴露后蛋白组及其相关功能信号的改变，旨                          Affinity Removal LC Column Human 14 / Mouse 3（Ag⁃
              在从整体方面阐述 METH 暴露引起的神经损伤，增                         ilent公司，美国）。
              强对 METH 神经毒性的系统认识。此外，在系统认                         1.2  方法
              识的基础上，对神经突触的表达、数量、联系的研                            1.2.1 原代神经元培养
              究，一方面阐述了 METH 引起神经元损伤的部分机                              取孕 18 d SD 大鼠的胎鼠脑皮质，经 2.0%的木
              制，另一方面也是对组学中神经损伤结果的进一步                            瓜酶消化，经100 μm及40 μm的滤网过滤，离心后，
              验证，从而为 METH 滥用引起的神经毒性提供潜在                         加入 5 mL 神经元培养液，以 5×10 个/mL 的密度接
                                                                                               5
              的干预靶点。                                            种，每隔3 d进行半量换液，待神经元长至8~10 d成
                                                                熟后进行后续实验。
              1  材料和方法
                                                                1.2.2 神经元蛋白组学的测定
              1.1  材料                                                FASP 酶 解 ：原 代 培 养 的 神 经 元 与 METH
                  18 d SD 清洁级孕大鼠均购自南京医科大学实                      （900 μmol/L）处理 24 h 后，提取蛋白并测浓度。各
              验动物中心，实验动物使用许可证号：SYXK（苏）                          组样品取 150 μg 蛋白质溶液，分别加入 DTT 至终
              2021⁃0001。动物饲养温度 20~26 ℃，湿度 40%~                  浓度为 100 mmol/L，与样本孵育后，加入200 μL UA
              70%，每 12 h 昼夜明暗交替实验中原代细胞培养获                       buffer，混合离心，后加入 IAA buffer，经 Trypsin 处理
              南京医科大学实验动物福利伦理委员会的批准（伦                            后，用C18 Cartridge 对肽段进行脱盐，肽段冻干后加
              理号：IACUC⁃1902013）。                                入 40 μL 0.1%甲酸溶液复溶，280 nm波长下进行肽

                  Easy nLC 色 谱 系 统 、Agilent 1260 infinity Ⅱ     段定量。
              HPLC 系统、Q Exactive 质谱仪（Thermo Fisher Scien⁃            Easy nLC 色谱分离：每份样品采用纳升流速
              tific 公司，美国），激光共聚焦显微镜（Zeiss 公司，德                  Easy nLC 系统进行分离。缓冲液 A 液为 0.1%甲酸
              国），低温高速离心机（5430R，Eppendorf 公司，德                   水 溶 液 ，B 液 为 0.1% 甲 酸 乙 腈 水 溶 液（乙 腈 为
              国），电泳仪、凝胶成像系统（BIO⁃RAD公司，美国），                      80%）。样品由自动进样器上样到分析柱分离，流速
              Multiskcan FC 酶标仪（Thermo Fisher Scientific公司，     为 300 nL/min。1.5 h 梯度：0~5 min，B 液 6%；5~
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