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第42卷第8期      彭 鹏，解翠薇，王 军，等. 甲基苯丙胺的神经毒性：基于蛋白组学的靶向神经突触损伤研究［J］.
                  2022年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1093-1099                      ·1095 ·


                75 min，B 液线性梯度 6%~38%；75~85 min，B 液线              光 4 ℃过夜，后加入荧光标记二抗及防荧光猝灭
                性梯度 38%~100%；85~90 min，B液维持在100%。                 DAPI 复合染料，激光共聚焦显微镜下拍照，计数。
                    质谱鉴定：样品经色谱分离后用 Q Exactive 质                   每皿细胞随机拍摄9个视野，实验重复3次。
                谱仪进行质谱分析。利用多肽和多肽碎片的质量                             1.3  统计学方法
                电荷比采集，每次全扫描后采集 10 个碎片图谱                               实验数据统计分析处理，使用SPSS20.0软件进
               （MS2 scan），仪 器 条 件 设 置 如 下 ：MS2 Activation         行统计学分析，多组定量资料比较采用单因素方差
                Type 为 HCD，Isolation window 为 2 m/z，二级质谱分         分析（one⁃way ANOVA）检验，多组数据间两两比较
                辨率 35 000，Microscans 为 1，二级 Maximum IT 为          选用Dunnett⁃t检验，两组定量数据比较用Student’s
                45 ms，Normalized Collision Energy 为 30 eV。        t 检验，P < 0.05 为差异有统计学意义，绘图使用

                    蛋白质定性和定量分析：通过 Proteome Discov⁃                GraphPad Prism 7.0。
                erer 2.1软件内置工具提交到 MASCOT2.6 服务器进
                                                                  2  结 果
                行数据库检索；通过Proteome Discoverer 2.1 将MAS⁃
                COT 服务器上形成的查库文件（.dat 文件）传回软                       2.1  同位素标记相对和绝对定量（iTRAQ）分析
                件，根据FDR<0.01 的标准对数据进行筛选，获得高                           同位素标记相对和绝对定量（isobaric tag for

                度可信的定性结果；使用数据库 Uniprot_RattusNor⁃                 relative and absolute quantitation，iTRAQ）是一种体
                vegicus_36080_20180123，针对质谱分析原始文件用                外同位素标记的蛋白质定性定量技术。为观察
                软件Mascot2.6和Proteome Discoverer2.1进行查库鉴           METH 对 原 代 神 经 元 蛋 白 质 的 表 达 改 变 ，通 过
                定及定量分析。根据上述定量定性分析结果，进行                            METH（900 μmol/L）处理原代神经元24 h，然后提取
                基因本体论（gene ontology，GO）、京都基因与基因组                  细胞蛋白进行 iTRAQ 分析。所鉴定蛋白按差异倍
                百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，     数和 P 值分布如图 1 所示，差异倍数和相应的蛋白
                KEGG）通路的分析。                                       质数量呈正态分布（图 1A），其中，METH 组与对照
                1.2.3 蛋白免疫印迹分析                                    组比差异蛋白共51个，其中表达上调的有40个，下
                    神经元裂解提取蛋白后，通过BCA法对蛋白进                         调的有11个，METH作用表达上调的蛋白较下调蛋
                行定量，每个泳道加入蛋白40 μg后电泳及转膜，5%                        白多（图1B）。
                的脱脂奶粉溶液封闭，后与一抗4 ℃孵育过夜，二抗                          2.2  GO功能注释
                常温孵育1 h，通过ECL发光检测成像。                                  用 序 列 比 对 工 具 NCBI BLAST +（ncbi ⁃ blast ⁃
                1.2.4 免疫荧光分析                                      2.3.0+）将 iTRAQ 分析得到的 51 种差异蛋白与蛋白
                    神经元固定（4%的多聚甲醛），清洗，透化后加                        序列数据库进行比对，批量提取GO 注释。通过 In⁃
                入10%山羊血清，37 ℃封闭60 min后，加入一抗，避                     terProScan 搜索 EBI 数据库将相关的功能信息注释

                        A                                              B
                                                                           4
                           2 000                                           3
                          Number of Proteins  1 500                       ⁃lg P value  2

                           1 000

                            500
                              0                                            1
                                 -0.75 -0.50  -0.25  0  0.25  0.50  0.75
                                                                           0
                                            log2 fold change
                                                                             -1           0           1
                                                                                      log2 fold change
                   A：两组蛋白差异的分布图。横坐标为将差异倍数以 2 为底作对数变换后所得数值，纵坐标为本次实验鉴定的蛋白质数量。结果鉴定出
                蛋白质总数为6 619个。与对照组比，表达差异倍数大于1.2倍（包含上调/下调蛋白）且P值<0.05的蛋白质为差异蛋白；B：两组样本蛋白质表
                达差异的火山图。左侧红圈代表下调蛋白数，右侧红圈代表上调蛋白数。横坐标为差异倍数（以2为底的对数变换）；纵坐标为P值（以10为
                底的对数变换）。
                                     图1  对照组与METH比较后，两组样本蛋白质表达差异分布和火山图
                      Figure 1  Analysis of the protein expression distribution and volcanic map of the control and METH groups
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