Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1050 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


              法 ［5-6］ ，能够精确检测10 nm范围内蛋白间的直接相                    1.2  方法
              互作用   ［7-8］ 。FRET是指能量从一种受激发的荧光基                   1.2.1 细胞培养
              团转移到另一种荧光基团的物理现象。前者称为                                  人肾上皮细胞系 293T 所用培养液为 DMEM 培
              供体，后者称为受体。利用荧光供体融合蛋白表达                            养基，并添加 10%的胎牛血清、100 U/mL 青霉素、
              载体和荧光受体融合蛋白表达载体共转染细胞，当                            100 μg/mL 链霉素。该细胞传代比例为 1∶4，在 CO2
              目的蛋白间发生相互作用时，使荧光基团间的距离                            浓度5%、温度37 ℃的细胞培养箱中进行培养。
              小于 10 nm，荧光基团将通过偶极子耦合作用实现                         1.2.2 质粒构建
              能量传递，供体荧光蛋白的能量可部分转移到受体                                 将 WNT3A 和 LRP6 的蛋白编码区（coding se⁃
              荧光蛋白，使受体被激发而发射荧光。在生物体                             quence，CDS）序列分别克隆到 pEYFP⁃C1 或 pECFP⁃
              内，如两个蛋白质分子的距离在10 nm之内，一般认                         C1 载体中，构建 ECFP⁃LRP6 和 EYFP⁃WNT3A 融合
              为这两个蛋白质分子存在直接相互作用。因此，通                            蛋白质粒。SP⁃EYFP⁃WNT3A 质粒是以 pCDNA3.1
              过检测供体和受体荧光强度的变化可观察两种目                             为质粒骨架，将EYFP荧光标签插入WNT3A蛋白的
              标蛋白在活细胞中的相互作用及变化。FRET 技术                          信号肽和成熟蛋白之间。SP⁃ECFP⁃LRP6 质粒是以
              的标准实验流程为，蛋白质三级结构分析、FRET标                          pCDNA3.1 为 质 粒 骨 架 ，将 ECFP 荧 光 标 签 插 入
              记策略的选择、荧光对的选择、FRET 效率评估、仪                         LRP6蛋白的信号肽和成熟蛋白之间（由于FRET 检
                                              ［9］
              器选择，最后进行 FRET 实验的实施 。但是，应用                        测要求荧光标签间距离在10 nm范围内。而LRP6成
              FRET 技术研究膜受体与胞外配体的相互作用时存                          熟蛋白的胞外结构域为棍棒结构，其长度＞20 nm，超
              在较多限制因素，其中主要包括膜受体结构对荧光                            出FRET实验检测范围。因此，将LRP6成熟蛋白胞
              共振能量转移效率的影响、荧光标签对膜受体的亚                            外结构域的 P1P2 结构域进行截短，保留 LRP6 与
              细胞定位及功能的影响、细胞切除成熟膜受体信号                            WNT3A相互作用的P3P4结构域。所有引物序列见
              肽时标记在信号肽氨基端的荧光标签会被一同切                             表 1。所有质粒均经测序确认（上海生工及安徽通
              除等。LRP6 是 WNT3A 的经典共受体            ［10］ ，根据其蛋      用测序公司）。
              白 质 三 级 结 构 相 互 作 用 模 型 ，WNT3A 蛋 白 与              1.2.3 蛋白质三级结构对接与分析
              LRP6 的氨基端都是开放末端，能够使用荧光蛋白                               在 PDB 数据库（https：//www1.rcsb.org/）中获取
              进 行 标 记 ，适 用 于 FRET 技 术 检 测 。 本 研 究 以             LRP6（PDB ID：3S8Z）及 WNT3A（PDB ID：7DRT）
              LRP6 膜受体与 WNT3A 相互作用为模型，针对上                       蛋白的晶体结构文件，下载 pdb 格式的蛋白模型
              述限制因素，通过蛋白截短、调整荧光标签和信                             数据，用 Pymol 软件打开进行后续分析。将需要
              号肽的相对位置及增添柔性链接肽等方法，有效                             对接的两个蛋白 pdb 格式文件添加到 Zdock 网
              提高了 FRET 的检测效率和准确性，为利用 FRET                       站（https：//zdock.umassmed.edu/）中 ，经 对 接 后 可
              技术研究膜受体与胞外配体相互作用提供了新                              下 载 蛋 白 复 合 物 模 型 文 件 。 在 Pymol 软 件
              的思路和策略。                                           （https：//pymol.org/2/）中打开对接模型文件，分析
                                                                观察目的蛋白的氨基端与羧基端是否暴露，能否
              1  材料和方法
                                                                在不影响蛋白质相互作用的前提下进行荧光标
              1.1  材料                                           签的标记。
                  FV1200 激光扫描共焦显微镜系统（Olympus 公                  1.2.4 FRET实验

              司，日本）；DMEM 细胞培养基（Invitrogen Life Tech⁃                 根据激光共聚焦显微镜（FV1200激光扫描共焦
              nologies 公司，美国）；Lipofectamine 3000 试剂盒（In⁃        显微镜，奥林巴斯公司，日本）FRET 实验手册进行
              vitrogen Life Technologies 公司，美国）；胎牛血清            了FRET实验的设计与实施。使用敏化荧光发射方
             （Gibco 公司，美国）；anti⁃GFP 抗体（Thermofisher 公           法进行 FRET 分析。FRET 实验细胞接种在玻璃底
              司，美国）；3.5 cm 玻璃皿（上海 WHB 生物技术有限                    培养皿（上海WHB 生物技术有限公司）。质粒通过
              公司）；胰蛋白酶（Sigma Chemical 公司，美国）；青霉                 Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美国）以 50%~
              素/链霉素（上海生工生物公司）；质粒小提试剂盒                           70%细胞汇合率转染培养细胞 24 h 后进行 FRET 分
             （AXYGEN 公司，美国）；PCR 试剂（TaKaRa 公司，                   析。根据实验手册调整相关的仪器配置，包括激光
              日本）。                                              功率 10%、HV 550 V、电压放大倍数×1、背景补偿
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