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第42卷第8期 马廷政，曹平平，汪徐春，等. 利用FRET技术检测膜受体与胞外配体相互作用的优化策略［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1049-1054 ·1053 ·

LRP6⁃ECFP通道 FRET通道（未校正） WNT3A⁃EYFP通道

4 095 4 095 4 095
3 071 3 071 3 071
2 047 2 047 2 047
1 023 1 023 1 023
10 μm 0 10 μm 0 10 μm 0
FRET通道（已校正） FRET Efficiency D⁃A Distance

4 095 100.00 100.00
3 071 75.000 75.000
2 047 50.000 50.000
1 023 25.000 25.000
10 μm 0 10 μm 0.0000 0.0000
LRP6与WNT3A荧光融合蛋白FRET图片，FRET实验显示LRP6与WNT3A细胞膜亚定位明显，并且在细胞膜上存在相互作用，红色箭头
指示细胞膜上发生的FRET现象。
图3 FRET技术检测WNT3A与LRP6蛋白间的相互作用
Figure 3 The interaction between WNT3A and LRP6 protein detected by FRET assays

三维结构空间上发生相互作用时，胞外端和配体荧光 割，也能够显著增强融合蛋白的膜定位信号。本文
［11］
对的距离大于10 nm（如 LRP6 及其配体 WNT3A 、 通过将信号肽重构在荧光标签的氨基末端，可避免
［12］
TNFRSF6B 及其配体 TNFSF14 等），超出 FRET 检 荧光标签的切除。该信号肽重构策略普遍适用于
测范围，因而不能利用 FRET 技术有效检测这一类 FRET质粒的构建，可避免荧光标签的丢失，增强信
膜受体和配体间的相互作用。本文针对这一制约 号肽的亚细胞定位功能。但是，不同膜受体的信号
因素，以经典的LRP6与其配体WNT3A相互作用模 肽功能多样 ［15］ ，信号肽重构对于不同膜受体家族的
型为基础，提供了一个可能的解决策略。LRP6胞外 亚细胞定位作用仍需进一步研究。
域全长约为25 nm，当LRP6与WNT3A相互作用时， 最后，荧光标签对蛋白质的结构与功能具有一
LRP6 的氨基端与 WNT3A 之间的距离约为 15 nm。 定干扰效应，可影响膜受体与胞外配体的亚细胞定
本研究依据 LRP6 蛋白三级结构特征，即其胞外域 位以及蛋白间相互作用。柔性连接肽在抗体、标签
结构为串珠状具有柔性 ［13］ 这一特点，将 LRP6 膜受 融合蛋白纯化等领域已被广泛应用 ［14］ ，用于减弱融
体进行截短，截掉P1P2结构域，保留其与WNT3A相 合蛋白内不同结构域之间的相互影响。与柔性连
互作用的 P3P4 结构域。由于结构域之间为柔性连 接肽相比，刚性连接肽可显著降低FRET效率，并且
接，截短不影响膜受体与配体的相互作用，同时满 FRET 效率随着刚性连接肽长度的增加而降低 ［16］ 。
足了 FRET 技术检测要求。对膜蛋白进行截短时， 并且，柔性连接肽已应用于生物发光共振能量转移
首先要确定截短对膜蛋白的结构与相互作用不会 （bioluminescence resonance energy transfer，BRET）实
造成影响。该策略适合检测细胞外有多个结构域 验，用来衔接荧光标签与目的蛋白，可减弱荧光标
的膜受体（如：TNFRSF、LRP 等家族蛋白）与其配体 签对融合蛋白结构与功能的影响 ［17-18］ 。基于以上研
的相互作用；且特别适用于检测有明确相互作用但 究，本文采用柔性连接肽来衔接信号肽、荧光标签
需要进一步在活细胞水平观察其相互作用动态变 及成熟蛋白，以降低荧光标签对 FRET 体系的影
化的配体和受体。 响。柔性连接肽策略同样适用于其他FRET荧光质
其次，膜受体与胞外配体的亚细胞定位由信号 粒的构建，但也有其局限性，与刚性连接肽相比，不能
肽进行引导，且成熟蛋白的信号肽会被切除 ［14］ ，导 有效分隔融合蛋白的不同结构域，因此不适用于胞外
致标记在信号肽氨基端的荧光标签被一同切除。 配体与多结构域膜受体相互作用位点的分析。
因此，信号肽位置的调整在膜受体与胞外配体相互 综上所述，本文以 LRP6 膜蛋白与 WNT3A 相互
作用的检测中非常必要，不仅可避免荧光标签被切 作用为模型，针对 FRET 技术在研究膜受体与胞外