Page 15 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期 朱海燕，赵晓晶，宋晶晶，等. 紫草素通过抑制氧化应激和神经炎症在脑外伤后发挥神经保护作用［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1055-1064 ·1057 ·

公司，美国）；GAPDH 抗体，兔二抗，鼠二抗（南京 （90%水，10%甲醛）中 24 h。在 4 ℃ 30 %的蔗糖溶
Bioworld 公司）；Bax 抗体，Bcl2 抗体，Caspase3 抗体 液连续脱水 3 d，每 24 h 更换新的蔗糖溶液，保证脑
（北京 Protein tech 公司）；伊文思蓝染液（Sigma⁃Al⁃ 组织充分脱水。包埋后将标本切成10 μm厚度的冰
drich 公司，美国）；小鼠脂质过氧化物（lipid perox⁃ 冻切片。使用含有 5 % BSA（胎牛血清）的 PBST 封
ides，LPO）ELISA试剂盒，小鼠SOD活性ELISA试剂 闭 1 h，加入一抗 4 ℃过夜孵育，二抗室温避光孵育
盒，GSH⁃Px/GPx 活性检测试剂盒，小鼠 ROS ELISA 2 h 后，滴加 DAPI 封片剂封片，立即拍片或者置于
试剂盒（南京翼飞雪生物科技公司）；脂质过氧化检 4 ℃避光保存。TUNEL 染色先选用 Tunel Bright⁃
测试剂盒，细胞凋亡与坏死检测试剂盒（上海碧云 Green 凋亡检测试剂盒（A112⁃01，南京诺维赞公司）
天生物科技有限公司）。 检测小鼠神经元的凋亡水平，按照试剂盒说明书先进

1.2 方法 行TUNEL染色后再进行同上操作的神经元染色。切
1.2.1 动物模型构建以及实验分组 片使用共聚焦显微镜（Zeiss，LSM800）拍摄。
将小鼠随机分组为假手术组（Sham组），TBI模型 1.2.5 Western blot检测相关蛋白表达

组（TBI组），TBI+1 mg/kg紫草素组（TBI+SK 1 mg/kg 取小鼠大脑损伤皮质区周围水肿带组织，约
组），TBI+5 mg/kg 紫草素组（TBI+SK 5 mg/kg 组）。 15 mg，置于 1.5 mL 离心管后置于液氮中低温速
对于脑外伤模型，基于先前的研究 ［14］ ，采取控制性 冻。用 RIPA 裂解液裂解匀浆，再用 BCA 蛋白定量
皮质撞击程序。将小鼠置于立体定位仪上，剪开头 后，用10%和15%的聚丙烯酰胺凝胶（SDS⁃PAGE）进
皮后，选用便携式钻机和3.5 mm的环钻在右侧顶颞 行电泳，转膜，含5%脱脂奶粉溶液的封闭液封闭，孵
皮层进行开颅，并保证硬脑膜的完整性。紧接着， 育一抗、二抗后，用化学发光（ECL）试剂检测蛋白质
用直径为 3 mm 的凸起尖端以 4.5 m/s 的速度产生 条带。GAPDH作为内参，用Image J进行分析。
1.2 mm 的凹陷，停留时间为 20 ms，造成中度损伤。 1.2.6 实时荧光定量PCR（RT⁃PCR）检测
迅速缝合头皮后将小鼠放回笼子。假手术进行除 取小鼠大脑损伤皮质区周围水肿带组织，置于
不进行撞击外，接受了同样的手术。所有小鼠均在 1.5 mL 离心管后置于液氮中低温速冻。用TRIzol试
接受手术后 1 h 内恢复意识。模型成功后，紫草素 剂（TaKaRa 公司，日本）对样本进行总RNA提取，再
腹腔注射，连续给药7 d。 用逆转录试剂盒（南京诺维赞公司）在 42 ℃ 60 min，
1.2.2 行为学检测 85 ℃ 5 s 条件下进行 cDNA 合成，用 Light Cycler 96
采用 Beamwalk 平衡木实验检测小鼠的运动功 实时荧光定量仪器（Roche公司，瑞士）进行cDNA扩
能，滑足次数越多，表示运动功能损害越严重。 增。总反应采用 20 μL 体系：2 μL 引物、3 μL 超纯
采用神经功能缺损评分（modified neurological 水 、5 μLcDNA、10 μL qPCR Master Mix（Without
severity score，mNSS）来评估小鼠的神经行为缺陷 ROX）（南京诺维赞公司）在 95 ℃ 10 s，60 ℃ 10 s，
的严重程度。在小鼠脑外伤后 24 h 检测，总分 18 72 ℃ 20 s 条件下进行 40 个循环。同样，GAPDH 作
分。从运动、感觉、平衡和反射能力四个方面进行 为内参基因，mRNA的水平用相对表达量 2 -ΔΔCT 进行
评估。mNSS得分越高，说明神经损伤越严重。 比较。引物如下：突触素（SYP），上游 5′⁃TTCAAG⁃
1.2.3 伊文思蓝染色 GAGCTAACTAACGA⁃3′，下游 3′⁃ CGTCACGAAGT⁃
通过伊文思蓝外渗实验检测小鼠血脑屏障的完 CCAGCAAGA ⁃ 5′ ；Bax，上 游 5′ ⁃ TGAAGACAGGG ⁃
整性和脑水肿程度。在小鼠造模后第7天进行，尾静 GCCTTTTTG⁃3′，下游 3′⁃AATTCGCCGGAGACAC⁃

脉注射100 μL的2% 的伊文思蓝溶液（4 mL/kg），2 h TCG⁃5′；Bcl2，上游5′⁃GTCGCTACCGTCGTGACTTC⁃
后观察到小鼠的四肢及眼球结膜变蓝，即注射成 3′，下游 3′⁃CAGACATGCACCTACCCAGC⁃5′；Cas⁃
功。再用 1%戊巴比妥钠将小鼠麻醉，经心脏灌注 pase3 上 游 5′ ⁃ ATGGAGAACAACAAAACCTCAGT ⁃
约20 mL的磷酸盐缓冲液。取脑称重，拍照，避光置 3′ ，下 游 3′ ⁃ TTGCTCCCATGTATGGTCTTTAC ⁃ 5′ ；
于甲酰胺溶液中匀浆，然后置于60 ℃恒温水浴孵育 GAPDH 上游 5′⁃AGGTCGGTGTGAACGGATTTG⁃3′，
24 h，16 000 g 离心 30 min，取上清。使用分光光度 下游3′⁃TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA⁃5′。
计检测上清在620 nm处的光密度值。 1.2.7 小鼠ROS、LPO和SOD活性检测
1.2.4 免疫荧光和TUNEL染色 取小鼠大脑损伤皮质区周围水肿带组织，并置
用上述同样方式灌注取脑，置于福尔马林溶液 于100 μL的PBS溶液种。将组织充分匀浆后，参照