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第42卷第8期
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              小鼠ROS ELISA试剂盒、小鼠LPO ELISA试剂盒、小                   统的血液灌注量。打击后，小鼠损伤区域立即出现
              鼠 SOD 活性 ELISA 试剂盒说明书进行标准曲线的                      血液灌注量减少（图 1B），提示造模成功。后续动
              绘制以及实验操作。在酶标仪 450 nm 波长下测定                        物实验流程如图 1C 所示。我们发现，TBI 后 1、3、
              吸光度（OD 值），样品中 ROS、LPO 和 SOD 活性的浓                  7、14 d，小鼠滑足次数都明显增多。而紫草素处理
              度由标准曲线计算得出。                                       7 d 以及 14 d 后，低剂量（1 mg/kg）的改善效果不显
              1.2.8 脂质氧化检测                                      著，高剂量（5 mg/kg）下可以显著减少滑足的次数，
                  采用脂质过氧化检测试剂盒测定小鼠脑中                            提示紫草素可以改善小鼠 TBI 后的运动功能（P <
              MDA 含量。取小鼠组织上清液 100 μL，与 MDA 检                    0.05，图1D~E）。此外，对小鼠进行mNSS评分，相对
              测工作液200 μL混匀，并于100 ℃加热15 min，冷却                   于 1 mg/kg 低剂量的轻微改善效果，5 mg/kg 高剂量
              至室温后，取200 μL上清加入到96孔板中，在酶标                        的紫草素显著地改善了小鼠的神经行为缺陷（P <
              仪 532 nm 波长处测定吸光度（OD 值），根据标准曲                     0.05，图 1F）。既往研究表明，TBI 后神经元大量丢
              线计算MDA含量。                                         失是造成脑外伤后认知和运动功能障碍的主要原因，
              1.2.9 Neuro⁃2a细胞系和BV2细胞系培养以及干预                    所以我们进一步检测了神经元丢失的情况。与对照
                  Neuro⁃2a 细胞系是小鼠来源神经瘤母细胞，                      组相比，TBI组损伤皮质周围水肿带的神经元数量显
              BV2细胞系是小鼠源性永生化的小胶质细胞。细                            著减少。同样，高剂量紫草素（5 mg/kg）处理可以显
              胞选用含 10 %的胎牛血清和 100 U/mL 的青霉素，                    著逆转这一现象（P < 0.05，图1G~H）。基于此，以下
              0.1 mg/mL 的链霉素的 DMEM 培养基在 T75 细胞培                 对组织的进一步检测和分析，均采用5 mg/kg高剂量
              养瓶中进行培养。按照 12 孔板每孔 1×10 ，6 孔板                     组的动物。SYP 作为脑内突触的特异性标记，在
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              1×10 的密度进行铺板。铺板后，随机分为 Control                     TBI 后其 mRNA 水平显著降低，而紫草素处理后升
              组 ，脂 多 糖（lipopolysaccharide，LPS）1 μg/mL 组 ，       高，提示了紫草素可以促进神经元的结构完整性
              LPS+SK（0.3、1.0 、3.0、10.0 μmol/L）组。LPS组：LPS        （P < 0.05，图1I）。为进一步探究紫草素针对血脑屏
              刺激 12 h；LPS+SK 组：在 LPS 刺激 12 h 后再给予不              障损伤的保护作用，采用伊文思蓝渗透实验评估血
              同浓度的紫草素（0.3、1.0 、3.0、10.0 μmol/L）孵育               脑屏障的完整性，结果发现，紫草素处理可以显著
              30 min。处理结束后收细胞，进行后续实验。                           改善 TBI 后导致的血脑屏障的破坏（P < 0.05，图
              1.2.10 凋亡检测                                       1J~K）。
                  采用细胞凋亡与坏死检测试剂盒检测神经元                           2.2  紫草素抑制小鼠脑外伤后的神经元凋亡
              细胞 Neuro⁃2a 细胞的凋亡情况。首先，将状态良好                           进一步研究发现，TBI 后小鼠皮质损伤周围水
              的神经元细胞Neuro⁃2a细胞系铺板至12孔板，分为                       肿带凋亡的神经元数量显著增加，而紫草素治疗后
              Control 组，LPS 1 μg/mL 组，LPS+SK 3 μmol/L 组，        可以改善这一现象（图 2A、B）。为了进一步探究紫
              LPS+SK 10 μmol/L组，处理完成后，收集细胞至流式                   草素对于脑外伤神经元凋亡的改善作用，我们检测
              管中，1 000 r/min，5 min离心，弃上清，再用PBS清洗                了 2 种重要的凋亡相关蛋白，即 Bax 和 Bcl2 的表达
              2 遍，避光加入 1 mL Annexin Ⅴ⁃FITC 检测工作液，               情况。TBI后Bax的表达显著上调，Bcl2的表达显著
              室温孵育10 min后，立即用流式细胞仪检测。                           下调，而紫草素可以促进Bcl2的表达，并抑制Bax的

              1.3  统计学方法                                        表达（P < 0.05，图 2C~E）。同时，TBI 后促进了凋亡
                  每组实验均为3次以上独立实验。所有数据采                          关键调控蛋白Caspase3以及剪切体p⁃Caspase3的表
              用Graphpad prism 8.0软件进行统计学分析，数据均                  达，而紫草素处理后显著抑制 TBI 诱导的 Caspase3
              以均值±标准差（x ± s）表示，组间比较采用单因素方                       的增加（P < 0.05，图 2C、F）。平行的 mRNA 水平的
              差分析，两两比较采用独立样本 t 检验，P < 0.05 为                    检测也验证了上述的结果（P < 0.05，图 2G~I）。依
              差异有统计学意义。                                         据已有的实验研究，TBI 后持续的炎症反应是继发
                                                                性损伤的重要因素，我们采用 LPS 刺激广泛使用的
              2  结 果
                                                                神经元细胞系N2a模拟TBI后的脑内炎症环境。体
              2.1  紫草素可改善小鼠脑外伤后神经功能缺陷                           外实验结果显示，LPS 处理可以诱导 N2a 细胞的凋
                  如图1A所示，采用控制性皮质撞击程序构建小                         亡增加，但是紫草素处理可以显著抑制 LPS 诱导的
              鼠脑损伤模型。采用激光多普勒监测脑微循环系                             细胞凋亡，促进细胞的存活（P < 0.05，图 2J~K），提
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