Page 9 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期 马廷政，曹平平，汪徐春，等. 利用FRET技术检测膜受体与胞外配体相互作用的优化策略［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1049-1054 ·1051 ·

表1 FRET实验中使用的引物
Table 1 Primers used in FRET assays
引物 序列（5′→3′）

ECFP⁃LRP6⁃F CGGGGTACCGAGAACGCGAGAAGGGAAGAT
ECFP⁃LRP6⁃R CGCGGATCCTGTACATGGTCTGCCTCATCCT
EYFP⁃WNT3A⁃F CCCAAGCTTATGGCCCCACTCGGATACTTCTTA
EYFP⁃WNT3A⁃R CCGGAATTCAGCCACCAGAGAGGAGACACTA
ECFP⁃LRP6⁃F1 CTCCTGGCCTGCAGCTTCTGTGTGCTCCTGAGAGCGGGATCCATGGTGAGCAAGGGC
ECFP⁃LRP6⁃F2 GGAATTCGCCACCATGGGGGCCGTCCTGAGGAGCCTCCTGGCCTGCAGCTTCTGTG
ECFP⁃LRP6⁃F3 TAACGGCCGCCAGTGTGCTGGAATTCGCCACCATGGGGGCCGTC
ECFP⁃LRP6⁃F4 GCGGTGGAGGTTCACTCGAGGAGGCTTTCCTTTTGTTTTCACGGAG
ECFP⁃LRP6⁃R1 GAAAACAAAAGGAAAGCCTCCTCGAGTGAACCTCCACCGCC
ECFP⁃LRP6⁃R2 GACACTATAGAATAGGGCCCTCTAGATTCAGGAGGAGTCTGTACAGGGAG
EYFP⁃WNT3A⁃F1 GGGGTACCGCCACCATGGCCCCACTCGGATACTTCTTACTCCTCTGCAGCCTGAAGCAG
EYFP⁃WNT3A⁃F2 TCCTCTGCAGCCTGAAGCAGGCTCTGGGCGGATCCATGGTGAGCAAGGGC
EYFP⁃WNT3A⁃F3 CCGCTCGAGAGCTACCCGATCTGGTGGTCGC
EYFP⁃WNT3A⁃R1 CCGCTCGAGGCCGGAGCCTCCCTTGTACAGCTCGTCCATGCCG
EYFP⁃WNT3A⁃R2 TGCTCTAGACTACTTGCAGGTGTGCACGTCG

0%、图像采集速度 2.0 μs/pixel，并使用 1 024×1 024 胞外区进行了截短，将LRP6的P1P2结构域截除，保
的图像格式。ECFP 通道由 440 nm 激光器激发，图 留LRP6的P3P4结构域（LRP6与WNT3A结合区域）
像采集使用滤波器（SMD510：480/20）。EYFP 通道 与LA结构域。
由 488 nm 激光器激发，图像采集使用 Mirror：565/ 2.2 FRET荧光融合蛋白的构建与优化
50。获取所有图像后，使用FV10⁃ASW软件（奥林巴 使用经典FRET荧光对ECFP与EYFP作为荧光
斯公司，日本）中的敏化荧光发射窗口进行FRET效 供受体，分别融合在 LRP6 或者 WNT3A 蛋白的 N 端
率及供受体距离的计算。 （图1B）。当两个目的蛋白不存在直接相互作用时，
1.3 统计学方法 使用 440 nm 激发光激发 ECFP 荧光标签时不发生
使用 FV10⁃ASW 4.0 软件进行 FRET 效率及供 FRET，只能使ECFP发出自身476 nm荧光，EYFP不
受体距离的统计学计算。采用 Graphpad 8.0 软件 发光；而当 2 个目的蛋白存在直接相互作用时，如
（https：//www.graphpad.com/）进行数据的处理和分 LRP6 与 WNT3A 相互作用，ECFP 与 EYFP 之间的距
析，定量结果表示为平均值±标准误（x ± SEM）。 离≤10 nm而发生FRET现象，即440 nm激发光激发
ECFP 后，通过 FRET 可检测到 EYFP 荧光标签发出
2 结 果
的527 nm峰荧光（图1A）。
2.1 LRP6与WNT3A蛋白质三级结构分析 依据PDB与Zdock网站对WNT3A与LRP6的蛋
LRP6膜受体的胞外区由3个结构域组成，依次 白三级结构分析结果，将构建 FRET 荧光融合蛋白
为 P1P2 结 构 域（PDB ID：5GJE），可 结 合 WNT1、 荧光标签ECFP及EYFP荧光标签分别融合在LRP6
WNT2、WNT6等配体；P3P4结构域（PDB ID：3S8Z）， 或者WNT3A的氨基端（图2A，上图），利用融合蛋白
可结合 WNT3、WNT3A、DKK1 等配体；LA 结构域 表达载体转染293T细胞，24 h后进行激光共聚焦显
（细胞膜锚定结构域）。利用 PDB 网站获取蛋白质 微镜观察，发现 LRP6 细胞膜定位不清晰（图 2B，上
三级结构，并使用 Zdock 数据库进行蛋白对接模型 图）。但是，使用 pCDNA3.1 作为载体，将 ECFP 荧
预测显示，LRP6 的 P3P4 结构域（PDB ID：3S8Z）与 光标签融合在 LRP6 蛋白的信号肽与成熟蛋白之
WNT3A（PDB ID：7DRT）的铰链区结合（图 1A），并 间，并使用柔性连接肽进行连接可减少对成熟蛋
且 LRP6 与 WNT3A 的氨基端和羧基端都是处于蛋 白结构与功能的影响（图 2A，下图）。转染 293T 细
白质外围开放末端，能够连接荧光标签进行FRET实 胞 24 h 后进行激光共聚焦显微镜观察显示，LRP6
验。LRP6胞外结构域为棍棒状结构，全长＞20 nm， 细胞膜定位较为明显（图 2B，下图白色箭头指示膜

超出常规FRET技术10 nm检测范围。因此对LRP6 定位）。