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第42卷第8期         武云慧，黄抱娣，茅春霞，等. 非标记定量蛋白质组学技术探讨不同透析龄患者腹膜透析流出
                  2022年8月            差异蛋白的研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1133-1141                  ·1135 ·


                1 min，滤纸吸去浮液，加入 15 μL 2%醋酸双氧铀染                                  表1 液相色谱洗脱条件
                                                                     Table 1 Liquid chromatography elution conditions
                色1 min，沉淀后吸去残液，白炽灯下烤10 min，TEM
                观察样本中有形物体的形态和大小；取2 μL样品置                              时间（min）                 流动相B比例（%）
                于新的离心管中，用 PBS 稀释至 1 mL，混匀后缓慢                          005                           005
                                                                      095                           028
                注入纳米颗粒跟踪分析仪中，进行粒径和浓度分
                                                                      110                           038
                析 ；免 疫 印 迹 法 检 测 外 泌 体 标 志 蛋 白 CD63 和
                                                                      115                           100
                TSG101，根据检测出的蛋白浓度，将样品原液稀释
                                                                      120                           100
                至所需的上样量，SDS⁃PAGE 电泳，转 PVDF 膜。用
                                                                                   ［8］
                5%脱脂牛奶室温摇床封闭 1 h，分别加入单克隆抗                         列和注释数据资源 。本研究产生的质谱原始文件
                体CD63、TSG101（均按照1∶1 500稀释），4 ℃摇床孵                 导入MaxQuant软件（版本号1.6.14.0）进行处理，并通
                育1 h，TBST清洗，再分别加入山羊抗兔IgG二抗（均                      过数据库 Uniprot_HomoSapiens_20367_20200226 检
                按照 1∶5 000 稀释），室温下摇床孵育 1 h，TBST 清                 索鉴定，所得文件采用 Perseus 1.3 软件以差异倍数
                洗，加入ECL发光液显影后采集图像。                                ＞2或＜0.5且P＜0.05为标准筛选差异蛋白。
                1.2.3 蛋白的提取和酶解                                    1.2.6 生物信息学分析

                    取样品加入适量SDT裂解液（4% SDS，100 mmol/L                   Blast2GO 数据库对筛选出的差异表达蛋白进
                Tris⁃HCl），沸水浴 15 min 后，14 000 g 离心 15 min，        行基因本体论（gene ontology，GO）功能富集；京都基
                提取上清液中的蛋白。BCA 法测定蛋白质浓度。                           因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes
                各样品取 20 μg，行 SDS⁃PAGE 电泳，考马斯亮蓝染                   and Genomes，KEGG）数据库软件进行通路分析。
                色。蛋白样品取 80 μg，分别加入 50 mmol/L DTT                  STRING和Cytoscape工具分析蛋白互作网络。
                还原，沸水浴 5 min，用 200 μL UA（8 mmol/L 尿素，             1.3  统计学方法
                150 mmol/L Tris⁃HCl）混匀，通过重复超滤除去洗涤                     采用SPSS 26软件进行数据分析。正态分布的
                剂、DTT 和其他低分子量组分。再加入 100 μL IAA                    计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，两组间差异比
                避 光 反 应 30 min，依 次 用 100 μL UA、25 mmol/L          较用 t 检验；非正态分布的计量资料以中位数（四
                NH4HCO3清洗过滤器。加入 40 μL 胰蛋白酶，37 ℃                   分位数）［M（P25，P75 ）］表示，两组间比较用 Mann⁃
                放置16 h，离心收集酶解上清液。采用C18 Cartridge                  Whitney U检验；计数资料组间比较采用Fisher精确
                对肽段进行脱盐，真空冻干，-20 ℃保存。                             概率检验。P＜0.05为差异有统计学意义。
                1.2.4 质谱数据采集
                                                                  2  结 果
                    在与 Easy⁃nLC 系统偶联的 Q⁃Exactive 质谱仪
                上，采集液相色谱⁃串联质谱（LC⁃MS/MS）数据。配                       2.1  一般临床资料比较
                制流动相 A 液（100%水、0.1%甲酸）和 B 液（80%乙                      本研究共纳入 10 例 PD 患者，NEP 组和 MPD 组
                腈、0.1%甲酸）。色谱柱以100%的A液平衡，取2 μg                     男女比均为3/2，两组患者在透析龄方面差异有统计
                样品进样，液质检测，液相色谱洗脱条件（表1）。使                          学意义（P＜0.05），在年龄、高血压、糖尿病、透析方
                用Q⁃Exactive质谱仪，检测方式为正离子，质谱采用                      案、腹膜平衡试验（peritoneal equilibration test，PET）
                数据依赖型采集模式，全扫描范围为350~1 800 m/z，                    值、估计肾小球滤过率（estimated glomerular filtration
                一级质谱分辨率设为 70 000，C⁃trap 最大容量为                     rate，eGFR）、尿素清除指数（urea clearance index，Kt/V）
                3×10 ，最大注入时间为 50 ms，每次全扫描后采集                      方面差异无统计学意义（P均＞0.05，表2）。
                    6
                10个碎片图谱；二级质谱检测中，分辨率设为17 500，                      2.2  PDE外泌体的鉴定
                AGC target 为 2×10 ，最大注入时间为 45 ms，碎裂碰                  电镜下观察到茶托状的双层膜包裹的圆形囊泡，
                                5
                撞能量设为27%，生成质谱检测原始数据。                              NTA对囊泡的粒径分析结果显示，大多数囊泡直径分
                1.2.5 蛋白的鉴定和定量分析                                  布在30~150 nm，免疫印迹结果显示利用超速离心得
                    MaxQuant 是基于质谱的蛋白质组学数据分析                      到的细胞外囊泡存在外泌体的标志蛋白 CD63 和
                最常用的平台之一，集成了多种算法用于高分辨率                            TSG101。证明从PDE中提取到外泌体（图1）。
                的定量质谱数据集 。Uniprot是目前国际上有关蛋                        2.3 蛋白鉴定和定量分析结果
                                ［7］
                白质信息最全面的非冗余数据库，具有丰富蛋白质序                               根据色谱分析及数据库比对，共鉴定出 499 种
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