Page 92 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期
·1134 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年8月

signaling pathway and Th17 cell differentiation signaling pathway，which play a key role in peritoneal injury. Conclusion：The
differentially expressed proteins screened by label ⁃ free quantitative proteomics technology could be used as candidate markers of
peritoneal injury in PD patients and provids molecular clues for revealing the peritoneal fibrosis mechanism of pathogenesis.
［Key words］ peritoneal dialysis；effluent；exosomes；proteomics；label⁃free technology
［J Nanjing Med Univ，2022，42（08）：1133⁃1141］

腹膜透析（peritoneal dialysis，PD）是终末期肾脏 PD＜1个月；③恶性肿瘤或严重创伤患者；④自身免
病患者广泛使用的肾脏替代治疗方式之一，PD的全 疫性疾病患者；⑤有肝炎、肝纤维化或结核病史患者；
球年增长率约为8%，已高于血液透析的增长率（约 ⑥1 个月内发生过腹膜炎症或其他严重感染患者。
6%~7%） 。随着透析时间的延长，腹膜结构和功 根据透析龄分为两组：初始腹透组（newly enrolled pa⁃
［1］
能受损，限制了治疗并导致患者的不良结局。相关 tients group，NEP组）（1个月≤透析龄≤2个月）；维持
机制尚不明确，其中人腹膜间皮细胞的上皮⁃间充质 腹 透 组（maintenance peritoneal dialysis patients
转化（epithelial⁃mesenchymal transition，EMT）被认为 group，MPD组）（24个月≤透析龄≤28个月）。最后，纳
是核心环节，EMT是上皮特征的逐步丢失和肌成纤 入NEP组和MPD组各5例患者，收集这些患者的一
［2］
维细胞样表型的获得 。腹膜活检仍然是识别腹膜 般临床资料。本研究经医院伦理委员会批准（审批文
病理改变的金标准，由于不易重复检查，并且存在 号：2020⁃SR⁃294），并获得患者的知情同意。
创伤风险，在临床上难以推广。因此，寻找早期识 SDS（上海生工），尿素（Bio⁃Rad 公司，美国），
别腹膜损伤的无创性生物标志物，指导个性化干 Tris（上海生工），HCl（北京国药），BCA 定量试剂盒
预，能够延长患者的PD时间。 （上海碧云天），30 kDa 超滤离心管（Sartorius 公司，
外泌体是一类直径为 30~150 nm 的细胞外囊 德国），IAA（Sigma 公司，美国），胰蛋白酶（Promega
泡，可由多种细胞分泌，包裹着蛋白质、脂质、DNA 公 司 ，美 国），Anti ⁃ CD63 抗 体（Ab216130）、Anti ⁃
和 RNA 等物质，介导细胞间的信号转导，这些物质 TSG101 抗体（Ab125011）（Abcam 公司，美国），辣根
几乎参与了所有的生理和病理过程，可作为液体活 过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG（A0208，上海碧云
检的重要标志物进行疾病诊断与治疗 ［3-4］ 。虽然研 天），C18 Cartridge（Waters 公司，美国），低速离心机
究证明腹膜透析流出液（peritoneal dialysis effluent， （湖 南 Cence TDZ5 ⁃ WS），超 速 离 心 机（Himac
PDE）中存在外泌体 ，但对PDE来源外泌体所携带 CP80WX，德国），透射电子显微镜（FEI，Tecnai G2
［5］
的蛋白质研究却少有报道。最新研究表明，PDE 中 Spirit，美国），纳米颗粒跟踪分析仪（Particle Metrix，
通过外泌体释放的水通道蛋白 1 与腹膜超滤效率 ZetaView PMX 110，德国），电泳系统（Bio⁃Rad 公司，
相关，可能是评估腹膜完整性的一种潜在生物标 美 国），Multiskcan FC 酶 标 仪 、高 效 液 相 色 谱 仪
［6］
志物 。本研究通过非标记定量蛋白质组学技术对 （EASY⁃nLC System，美国）、质谱系统（Q⁃Exactive，
不同透析龄患者 PDE 外泌体蛋白进行鉴定和定量 Thermo Fisher Scientific公司，美国）。
分析，筛选差异蛋白，通过生物信息学分析差异蛋 1.2 方法
白功能及生物学过程，寻找腹膜损伤的生物标志物 1.2.1 外泌体的分离
及探讨发病机制提供了参考依据。 收集每例患者行腹膜平衡试验前 1 d 100 mL
留腹过夜的 PDE，放入 4 ℃预冷离心机，于 300 g离
1 对象和方法
心 10 min、2 000 g离心 10 min 去除死细胞后，取上
1.1 对象 清液转移至超速离心机配套的离心管中，在 4 ℃下
选取 2020 年 5—7 月于南京医科大学第一附属 10 000 g 离心 30 min 去除细胞碎片，100 000 g 离心
医院腹膜透析中心行稳定PD 治疗并规律随访的患 70 min，取透明沉淀，并分别用磷酸盐缓冲液（phos⁃
者。透析方案为持续性非卧床腹膜透析（continu⁃ phate buffer solution，PBS）1 055 、1 015 、1 015 μL 重
ous ambulatory peritoneal dialysis，CAPD）或日间非卧 悬，-80 ℃保存以备下一步检测。
床腹膜透析（daytime ambulatory peritoneal dialysis， 1.2.2 外泌体的鉴定
DAPD）。排除标准：①年龄＜18 岁或＞80 岁；② 取15 μL样品在电镜测试的铜网上室温下静置