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第42卷第9期         伍雪橙，李     南，黄 文，等. 吸入CDDO⁃NO对野百合碱诱导的大鼠肺动脉高压的作用［J］.
                  2022年9月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（09）：1201-1208                      ·1203 ·


               （hematoxylin⁃eosin，HE）染色试剂盒（上海碧云天生                 每个样本拍摄20个直径30~100 μm的小动脉，选取
                物技术有限公司），抗α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth                      血管长轴和短轴并用Image Pro Plus 6.0软件分别测
                muscle actin，α⁃SMA）抗体（Abcam公司，英国），马松              量其内径和外径，计算 PAMT=［（外径-内径）/外
                三色染色（Masson trichrome staining，MTS）试剂盒            径］×100%。
               （北京索莱宝科技有限公司），口鼻暴露式雾化吸入                            1.2.5  HE 染色检测心肌细胞横截面积（cross⁃sec⁃
                装置（Scireq公司，加拿大）。                                 tional area，CSA）
                1.2  方法                                               收集右心组织后置于 4%多聚甲醛固定，常规
                1.2.1 建立MCT诱导的大鼠PAH模型和给药方案                        石蜡包埋切片后行 HE 染色，置于光学显微镜下
                    SD 大鼠 36 只，自适应 1 周后随机分为 6 组（每                （×400）观察右心室心肌细胞横截面，采用Image J软

                组 6 只）：①对照组（Con 组）；②MCT 组；③MCT+                   件随机统计20个心肌细胞的CSA。
                10 μg/kg CDDO⁃NO 组（MCT+10NO 组）；④MCT+              1.2.6  Masson 三色染色测定肺小动脉外膜胶原纤
                30 μ g/kg CDDO⁃NO 组（MCT+30NO 组）；⑤MCT+             维沉积百分比
                7 μg/kg CDDO⁃Me组（MCT+7Me组）；⑥MCT+21 μg/kg              肺组织石蜡切片均按 Masson 三色染色试剂盒
                CDDO⁃Me 组（MCT+21Me 组）。其中③和⑤组属低                    步骤说明进行操作。光镜下（×400）随机选取 15~
                剂量药物组，④和⑥组属高剂量药物组。Con 组腹                          20 个肺小动脉，Image Pro Plus 6.0 软件统计胶原纤

                腔注射生理盐水 1 mL，其余各组均给予 60 mg/kg                     维沉积（蓝色）面积与总面积的比值，评估肺小动脉
                MCT 腹腔注射1次造模，药物治疗各组在MCT 注射                        外膜纤维化程度。
                1 h 后通过口鼻暴露式雾化吸入装置给药。后每日                          1.2.7  α⁃SMA 免疫组织化学染色测定肺小动脉肌
                雾化吸入给药，共28 d。                                     化程度
                1.2.2  右心导管测定大鼠右心室收缩压（right ven⁃                      石蜡切片脱蜡水化，抗原修复液微波修复，3%
                tricular systolic pressure，RVSP）                  双氧水浸泡 15 min 灭活过氧化物酶，5%BSA 封闭
                    大鼠腹腔注射 2%戊巴比妥钠（60 mg/kg）充分                    30 min，滴加1∶200的α⁃SMA 一抗工作液于玻片上，
                麻醉后仰卧位固定，颈前区作一 2~3 cm 切口，钝性                       4 ℃孵育过夜，二抗1∶2 000孵育1 h，二氨基联苯胺
                分离颈部皮下组织并剥离颈外及颈内静脉，选择颈                            显色10 min后自来水冲洗，苏木素快速染色10~30 s，
                外或颈总静脉剪一 V 型切口，微型导管连接压力传                          自来水冲洗，脱水透明后中性树胶封片。光学显微
                感器（TSD104A 压力换能器，BIOPAC Systems 公司，               镜下观察（×400），根据肺小动脉α⁃SMA阳性表达部
                美国），经静脉切口送入上腔静脉，根据16通道生理                          分（棕黄色）占血管周径的比例，将其分为非肌化
                信号记录分析仪（MP100，BIOPAC Systems，美国）上                （<25%）、部 分 肌 化（25%~75%）和 完 全 肌 化（>
                显示的波形变化判断导管位置，当导管到达右心室                            75%）3种类型的血管，统计各类型血管所占百分比。
                后记录RVSP。                                          1.3  统计学方法
                1.2.3  测定右心肥厚指数（right ventricular hypertro⁃           数据分析及作图采用 GraphPad Prism 6.0 软
                phy index，RVHI）及右室/体重比（RV⁃to⁃body weight          件。所有数据以均数±标准差（x ± s）表示。单因素
                ratio，RV/BW）                                      多个样本均数比较采用单因素方差分析，组间比较
                    RVSP 测定完毕后收集大鼠心脏组织，沿室间                        使用 LSD 法。两因素多个样本均数比较采用双因

                隔边缘游离出右心室（right ventricle，RV）及左心室+                素方差分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
                室间隔（left ventricle+septum，LV+S）。滤纸吸干水
                                                                  2  结 果
                分后分别称量 RV 和 LV+S，计算 RV/（LV+S）比值，
                即为 RVHI。隔日称量大鼠体重，计算大鼠第 29 天                       2.1  CDDO⁃NO 对 MCT 诱导的 PAH 大鼠体重增长、
                的RV/BW。                                           RVSP、RVHI和RV/BW的影响

                1.2.4  HE 染色检测肺小动脉中膜层厚度（pulmo⁃                        大鼠体重监测结果显示：与Con组相比，MCT造
                nary artery medial thickness，PAMT）                模可使大鼠体重增长显著减少，差异有统计学意义
                     收集大鼠肺组织，置于 4%多聚甲醛中固定                        （P < 0.05，图 1A）。与 MCT 组相比，低剂量药物组
                24 h后石蜡包埋，制成5 μm切片后进行HE染色，于                      （MCT+10NO 组和 MCT+7Me 组）可改善大鼠体重增
                光学显微镜下（×400）观察肺小动脉形态学改变。                          长（P < 0.05，图 1A），而高剂量组（MCT+30NO 组和
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