Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第11期
               ·1504 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年11月


              手术及术后放化疗是其临床主要的治疗方式。但                             种于6孔板，每孔接种约400个细胞，待细胞贴壁后，
              因手术切除范围较广、切除不彻底，化疗药物细胞                            分别加入 0、40、80 μmol/L 的 RGFP966 进行处理。
              毒性强、易耐药等缺点，术后患者生活质量差，因此                           放入培养箱中培养 14 d，视情况换液，14 d 后用 3%
                                       ［2］
              迫切需要寻求新的治疗药物 。近年来随着表观遗                            多聚甲醛固定，结晶紫染色，拍照计数，使用Image J
              传学的发展，越来越多的研究发现，表观遗传修饰与                           进行分析统计。
                                      ［3］
              胃癌的发生发展密切相关 。组蛋白去乙酰化酶                             1.2.4  细胞周期检测实验
             （histone deacetylase，HDAC）对染色体的结构修饰                     收集对数生长期细胞，使用细胞计数板计数，接
                                               ［4］
              以及基因表达调控发挥着重要作用 。现已有研                             种于 6 孔板，每孔接种约 1×10 个细胞，待细胞贴壁
                                                                                           5
              究证明高选择性的HDAC3抑制剂RGFP966对肝癌、                       后，分别加入 0、40、80 μmol/L 的 RGFP966 进行处
              结直肠癌、前列腺癌等肿瘤细胞具有抑制作用                    ［5-7］ ，但  理。48 h后，吸除培养液，PBS清洗，1 500 r/min离心
              RGFP966 对胃癌细胞的作用及其机制尚无报道，本                        5 min，收集细胞沉淀，在细胞沉淀中加入70%预冷

              研究主要探讨RGFP966对胃癌细胞MKN⁃45和MGC                      乙醇 500 μL重悬，置于4 ℃冰箱固定过夜，第2天用
              ⁃803增殖能力的影响，并探讨其可能的作用机制。                          PBS洗去固定液，然后200目筛网过滤，加入100 μL
                                                                RNaseA 溶液，37 ℃水浴30 min，再加入400 μL PI染
              1  材料和方法
                                                                液，置于4 ℃避光孵育30 min，使用流式细胞术检测。

              1.1  材料                                           1.2.5  Western blot
                  人胃癌细胞 MKN⁃45 和 MGC⁃803（ATCC 公司，                    收集对数生长期细胞，使用细胞计数板计数，
              美国）；胎牛血清、DMEM 培养基（Gibco 公司，美                      接种于 6 孔板，每孔接种约 1×10 个细胞，待细胞贴
                                                                                              5
              国）；RGFP966（MCE 公司，美国）；CCK⁃8 试剂（武                  壁后，分别加入0、40、80 μmol/L 的 RGFP966 进行处
              汉 Abbkine 公 司）；细 胞 周 期 检 测 试 剂 盒（武 汉              理。48 h后使用RIPA裂解液提取蛋白，分别加入蛋
              Elabscience 公司）；Ki⁃67 抗体、c⁃Myc 抗体、Cyclin          白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂，使用考马斯亮蓝G250
              A2 抗体（Abcam 公司，英国）；Cyclin D1 抗体（Cell              测定蛋白浓度。然后加入5×上样缓冲液，95 ℃金属
              Signaling Technology 公司，美国）；PI3K抗体、p⁃PI3K         浴10 min，SDS⁃PAGE凝胶电泳，使用PVDF膜转膜，
              抗体、AKT 抗体、p⁃AKT 抗体（武汉爱博泰克生物科                      用5%脱脂牛奶或5%牛血清白蛋白封闭1 h。4 ℃孵
              技有限公司）。                                           育一抗过夜，第2天TBST清洗3遍，每次 10 min。室
              1.2  方法                                           温孵育二抗2 h，TBST清洗3次，每次10 min，曝光。
              1.2.1  细胞培养                                       1.3  统计学方法
                  人胃癌细胞MKN⁃45和MGC⁃803使用含有10%                         使用Graphpad Prism 9.0软件进行分析，符合正
              胎牛血清、1%青霉素和链霉素的完全 DMEM 培养                         态分布的计量资料用均值±标准差（x ± s）表示，采用
              基，放入 5%CO2、37 ℃恒温培养箱中培养，2~3 d 换                   ANOVA法进行分析。P＜0.05为差异有统计学意义。
              液，使细胞维持在对数生长期。RGFP966 溶解于
                                                                2  结 果
              DMSO中，调整浓度为10 mmol/L于-20 ℃储存。
              1.2.2 CCK⁃8实验                                     2.1 RGFP966抑制胃癌细胞的增殖
                  收集对数生长期的细胞，使用细胞计数板计数，                              RGFP966 有抑制胃癌细胞 MKN⁃45、MGC⁃803
              然后接种于96孔板中，每个孔接种约3 000个细胞，                        增殖的效果，且呈剂量依赖性，此外 RGFP966 处理

              待细胞贴壁后分别加入0、40、80 μmol/L的RGFP966                  48 h时细胞活性明显低于处理24 h时（图1）。
              进行处理。放入培养箱中培养 24、48 h，然后每孔                        2.2  RGFP966抑制胃癌细胞的集落形成能力
              加 10%的 CCK⁃8 试剂，培养箱中孵育约 2 h，使用                         RGFP966 有抑制胃癌细胞 MKN⁃45、MGC⁃803
              酶标仪测定 450 nm 处吸光度值。利用公式计算                         集落形成的能力（图2A），且呈剂量依赖性。不同浓
              RGFP966 对胃癌细胞增殖能力的影响。计算公式                         度 RGFP966 处理细胞的集落形成数量的差异有统
              为：细胞活力（%）=［（实验孔吸光度-空白孔吸光                          计学意义（图2B）。
              度）/（对照孔吸光度-空白孔吸光度）］×100%。                         2.3 RGFP966诱导胃癌细胞发生G0/G1期阻滞

              1.2.3  细胞克隆形成实验                                        RGFP966处理后胃癌细胞G0/G1期占比上升，S
                  收集对数生长期细胞，使用细胞计数板计数，接                         期与 G2/M 期均减少，这说明细胞发生 G0/G1 期阻
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