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第43卷第12期 黄凯玥,张 伟,朱玉婕,等. 氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究[J].
2023年12月 南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(12):1630-1635 ·1631 ·
暴露于不良环境中,如环境污染、酒精、烟草和药物 后收集受精卵,并用胚胎培养液(5 mmol/L NaCl、
暴露(如抗高血压药、抗惊厥药、抗抑郁药等)都会 0.17 mmol/L KCl、0.14 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L
极大增加胎儿CHD发生 [1,3-5] 。 MgSO4 )于28.5 ℃恒温光照培养箱中继续孵育。
氯氮平(clozapine,CLP)是一种非典型抗精神病 1.2.2 药物处理及分组
药,可抑制多巴胺 D2 受体并拮抗 5⁃羟色胺 2C 受体 将受精正常的受精后 0 h(0 hours past fertiliza⁃
(5⁃hydroxytryptamine receptor 2C,HTR2C) ,其对 tion,0 hpf)斑马鱼胚胎随机地吸到 6 孔培养板中,
[6- 7]
难治性精神分裂症和双相情感障碍具有良好的治疗 每孔 30 个,用不同浓度的处理液进行处理,其中
效果,但也存在着严重的不良反应,会引起心动过速、 12.5 μmol/L 氯氮平作为低剂量处理组(L⁃CLP),
高血压或低血压、晕厥、心肌炎、心包炎和中性粒细胞 25.0 μmol/L 氯氮平作为高剂量处理组(H⁃CLP),
[8]
减少等症状 。调查发现,育龄和孕期妇女越来越多 DMSO作为溶剂对照。加入4⁃苯基丁酸或溴隐亭处理
[9]
地使用抗精神病药物 。临床数据显示,氯氮平可穿 时,首先利用25 μmol/L氯氮平处理斑马鱼胚胎24 h,
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过胎盘屏障 ,影响胎儿发育 。动物实验发现,胚 然 后 加 入 10 mmol/L 4⁃ 苯 基 丁 酸(CLP+4⁃PBA)
[10]
胎期斑马鱼暴露于氯氮平,导致其心包水肿、心室和 或溴隐亭(CLP+BRC)共同处理至 72 hpf,检测相应
心房狭窄、心肌细胞减少、心动过缓等异常表型 。 的心脏发育相关指标,每个实验均重复3次。
[12]
以上的研究表明,胚胎期氯氮平暴露会影响心脏发 1.2.3 斑马鱼心脏结构与功能检测
育,但是其影响心脏发育的作用机制尚不明确。 斑马鱼胚胎于72 hpf时,置于倒置显微镜下观察
内质网是进行蛋白质合成、折叠、易位等过程 其心包水肿情况,记录并统计斑马鱼心率,拍摄斑马
的细胞器,生理或病理下内质网功能扰乱时,导致 鱼侧体位图像,并测量静脉窦⁃动脉球(sinus venosus⁃
错误折叠和展开的蛋白质的积累,这种情况被称为 bulbus arteriosus,SV⁃BA)间距,用于表征其心脏线性
[15]
[13]
内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS) 。 化程度 ,于72 hpf在倒置荧光显微镜下观察转基因
ERS与多种心脏功能损伤相关,包括能量代谢、心脏 斑马鱼Tg(Cmlc2:EGFP)的心脏结构。
[14]
生成、缺血/再灌注、心肌病和心力衰竭等 。氯氮平 1.2.4 RNA 提取和实时荧光定量聚合酶链反应
对心脏发育的毒性是否与内质网应激相关,目前还未 (RT⁃qPCR)
有研究报道。本研究以斑马鱼胚胎为模型,探讨胚胎 各组于72 hpf收集15只斑马鱼胚胎,使用TRIzol
期氯氮平暴露对心脏发育的影响及其作用机制。 法抽提总 RNA,按照诺唯赞 HiScript Ⅱ 1st Strand
cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行操作,取 1 μg
1 材料和方法
RNA 合成cDNA,使用SYBR⁃Green 对每个选定基因
1.1 材料 进行RT⁃qPCR反应,引物序列见表1。以GAPDH作
氯氮平(上海源叶生物公司);溴隐亭(bro⁃ 为内参,实验数据以2 -△△Ct 方法进行分析。
mocriptine,BRC,上海麦克林公司);4⁃苯基丁酸(4⁃ 1.3 统计学方法
phenylbutyric acid,4⁃PBA,上海阿拉丁公司);HiS⁃ 斑马鱼 SV⁃BA 距离用软件 Image J 软件进行统
cript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+gDNA wip⁃ 计。全部数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析,
er)、ChamQ SYBR qPCR Master Mix(Without ROX) 结果用平均值±标准差(x ± s)表示,采用单因素方差
(南京诺唯赞公司);TRIzol(Life technologies 公司, 分析比较各组间的统计学差异,采用SNK法进行组
美国);荧光倒置显微镜(OLYMPUS 公司,日本);荧 间比较,P < 0.05为差异有统计学意义。
光定量PCR仪(Roche公司,瑞士)。
2 结 果
1.2 方法
1.2.1 斑马鱼喂养 2.1 氯氮平导致斑马鱼胚胎心脏发育缺陷
野生型AB 品系斑马鱼及心脏特异表达绿色荧 为探究氯氮平对胚胎心脏发育的影响,使用含
光转基因Tg(Cmlc2:EGFP)均由中国科学院水生生 有氯氮平的培养液处理斑马鱼胚胎。根据既往研究,
物研究所提供,斑马鱼于28.5℃循环水系统中喂养, 选择低剂量(12.5 μmol/L)及高剂量(25.0 μmol/L)的
光照周期为照射 14 h,黑暗 10 h。收集胚胎时将文 氯氮平处理胚胎。低浓度氯氮平处理的斑马鱼胚
中斑马鱼按照雌雄比 3∶2 放入交配缸中,于次日早 胎脊柱出现轻微弯曲(5.6%),高剂量氯氮平导致脊
上抽去隔板利用光照刺激交配反射,抽去隔板1~2 h 柱严重弯曲(12.4%),且出现腹腔水肿(图 1A)。与