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第43卷第12期              黄凯玥，张 伟，朱玉婕，等. 氯氮平对斑马鱼心脏发育的影响及机制研究［J］.
                 2023年12月                    南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（12）：1630-1635                      ·1631 ·


                暴露于不良环境中，如环境污染、酒精、烟草和药物                           后收集受精卵，并用胚胎培养液（5 mmol/L NaCl、
                暴露（如抗高血压药、抗惊厥药、抗抑郁药等）都会                           0.17 mmol/L KCl、0.14 mmol/L CaCl2、0.16 mmol/L
                极大增加胎儿CHD发生          ［1，3-5］ 。                    MgSO4 ）于28.5 ℃恒温光照培养箱中继续孵育。
                    氯氮平（clozapine，CLP）是一种非典型抗精神病                  1.2.2 药物处理及分组
                药，可抑制多巴胺 D2 受体并拮抗 5⁃羟色胺 2C 受体                         将受精正常的受精后 0 h（0 hours past fertiliza⁃
               （5⁃hydroxytryptamine receptor 2C，HTR2C）  ，其对       tion，0 hpf）斑马鱼胚胎随机地吸到 6 孔培养板中，
                                                     ［6- 7］
                难治性精神分裂症和双相情感障碍具有良好的治疗                            每孔 30 个，用不同浓度的处理液进行处理，其中
                效果，但也存在着严重的不良反应，会引起心动过速、                          12.5 μmol/L 氯氮平作为低剂量处理组（L⁃CLP），
                高血压或低血压、晕厥、心肌炎、心包炎和中性粒细胞                          25.0 μmol/L 氯氮平作为高剂量处理组（H⁃CLP），
                          ［8］
                减少等症状 。调查发现，育龄和孕期妇女越来越多                           DMSO作为溶剂对照。加入4⁃苯基丁酸或溴隐亭处理
                                  ［9］
                地使用抗精神病药物 。临床数据显示，氯氮平可穿                           时，首先利用25 μmol/L氯氮平处理斑马鱼胚胎24 h，
                                          ［11］
                过胎盘屏障 ，影响胎儿发育 。动物实验发现，胚                           然 后 加 入 10 mmol/L 4⁃ 苯 基 丁 酸（CLP+4⁃PBA）
                          ［10］
                胎期斑马鱼暴露于氯氮平，导致其心包水肿、心室和                           或溴隐亭（CLP+BRC）共同处理至 72 hpf，检测相应
                心房狭窄、心肌细胞减少、心动过缓等异常表型 。                           的心脏发育相关指标，每个实验均重复3次。
                                                          ［12］
                以上的研究表明，胚胎期氯氮平暴露会影响心脏发                            1.2.3 斑马鱼心脏结构与功能检测
                育，但是其影响心脏发育的作用机制尚不明确。                                 斑马鱼胚胎于72 hpf时，置于倒置显微镜下观察
                    内质网是进行蛋白质合成、折叠、易位等过程                          其心包水肿情况，记录并统计斑马鱼心率，拍摄斑马
                的细胞器，生理或病理下内质网功能扰乱时，导致                            鱼侧体位图像，并测量静脉窦⁃动脉球（sinus venosus⁃
                错误折叠和展开的蛋白质的积累，这种情况被称为                            bulbus arteriosus，SV⁃BA）间距，用于表征其心脏线性
                                                                        ［15］
                                                          ［13］
                内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS） 。         化程度 ，于72 hpf在倒置荧光显微镜下观察转基因
                ERS与多种心脏功能损伤相关，包括能量代谢、心脏                          斑马鱼Tg（Cmlc2：EGFP）的心脏结构。
                                                   ［14］
                生成、缺血/再灌注、心肌病和心力衰竭等 。氯氮平                          1.2.4  RNA 提取和实时荧光定量聚合酶链反应
                对心脏发育的毒性是否与内质网应激相关，目前还未                          （RT⁃qPCR）
                有研究报道。本研究以斑马鱼胚胎为模型，探讨胚胎                               各组于72 hpf收集15只斑马鱼胚胎，使用TRIzol
                期氯氮平暴露对心脏发育的影响及其作用机制。                             法抽提总 RNA，按照诺唯赞 HiScript Ⅱ 1st Strand
                                                                  cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书进行操作，取 1 μg
                1  材料和方法
                                                                  RNA 合成cDNA，使用SYBR⁃Green 对每个选定基因
                1.1  材料                                           进行RT⁃qPCR反应，引物序列见表1。以GAPDH作
                    氯氮平（上海源叶生物公司）；溴隐亭（bro⁃                        为内参，实验数据以2         -△△Ct 方法进行分析。
                mocriptine，BRC，上海麦克林公司）；4⁃苯基丁酸（4⁃                 1.3  统计学方法
                phenylbutyric acid，4⁃PBA，上海阿拉丁公司）；HiS⁃                斑马鱼 SV⁃BA 距离用软件 Image J 软件进行统
                cript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit（+gDNA wip⁃  计。全部数据采用SPSS 19.0统计学软件进行分析，
                er）、ChamQ SYBR qPCR Master Mix（Without ROX）       结果用平均值±标准差（x ± s）表示，采用单因素方差
               （南京诺唯赞公司）；TRIzol（Life technologies 公司，             分析比较各组间的统计学差异，采用SNK法进行组
                美国）；荧光倒置显微镜（OLYMPUS 公司，日本）；荧                      间比较，P < 0.05为差异有统计学意义。
                光定量PCR仪（Roche公司，瑞士）。
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                1.2  方法
                1.2.1 斑马鱼喂养                                       2.1  氯氮平导致斑马鱼胚胎心脏发育缺陷
                    野生型AB 品系斑马鱼及心脏特异表达绿色荧                             为探究氯氮平对胚胎心脏发育的影响，使用含
                光转基因Tg（Cmlc2：EGFP）均由中国科学院水生生                      有氯氮平的培养液处理斑马鱼胚胎。根据既往研究，
                物研究所提供，斑马鱼于28.5℃循环水系统中喂养，                         选择低剂量（12.5 μmol/L）及高剂量（25.0 μmol/L）的
                光照周期为照射 14 h，黑暗 10 h。收集胚胎时将文                      氯氮平处理胚胎。低浓度氯氮平处理的斑马鱼胚
                中斑马鱼按照雌雄比 3∶2 放入交配缸中，于次日早                         胎脊柱出现轻微弯曲（5.6%），高剂量氯氮平导致脊
                上抽去隔板利用光照刺激交配反射，抽去隔板1~2 h                         柱严重弯曲（12.4%），且出现腹腔水肿（图 1A）。与
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