Page 56 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第2期
               ·198 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


              用美国Promega公司双荧光素酶报告基因检测系统
                                                                2  结 果
              检测相对荧光素酶活性。
              1.2.4 CCK⁃8检测细胞活力                                 2.1  circFAT1、miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p 在 OSCC
                  细胞转染后，将SCC⁃25或HSC⁃3细胞（1×10 个/孔）               组织和细胞中的表达及关系
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              接种到96孔板中。培养72 h后，采用北京索莱宝科                              利用 starBase 及 GSE131182 数据集鉴定出 7 个
              技有限公司的CCK⁃8溶液与细胞反应3 h左右。随                         circRNA（NCOA1、ATXN1、FAT1、TNPO3、FNDC3B、
              后，使用 SpectraMax iD3 酶标仪分析细胞的相对存                   SSH2、MAP3K4）（图1A），它们既有miR⁃181/miR⁃199
              活率。                                               海绵吸附结合位点，同时也是OSCC相关的circRNA。
              1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭                          进一步验证发现，在 OSCC 组织和细胞中，circFAT1
                  Transwell 实验被用于测定目的基因对 OSCC 细                 的表达升高，而miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p表达下降
              胞迁移和侵袭的影响。不同的是在侵袭实验中，                             （P < 0.001，图1B~G）。图1H⁃I分别显示了circFAT1
              Transwell 小室要预先加入北京索莱宝的基质胶处                       与miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p的结合位点，双荧光素

              理。随后，转染的细胞消化重悬后被加入到 Tran⁃                         酶报告基因实验验证了 miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p
              swell上室在无血清的培养基中培养，而Transwell下                    均 可 以 作 为 circFAT1 的 靶 miRNA（P < 0.01，图
              室加入含有胎牛血清的完全培养基，培养 48 h。固                         1J~M）。
              定液固定细胞后，用北京索莱宝的 0.1% 的结晶紫                         2.2  circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p
              染色；镜检结果，并记录数据。                                    影响OSCC细胞活力
              1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡和细胞周期                                 图 2A 显示 siFAT1 显著降低了 circFAT1 水平
                  采用上海碧云天公司的细胞周期检测试剂盒                           （P < 0.001），miR⁃181d⁃5p inhibitor 对 circFAT1 水平
              检测细胞周期，Annexin V⁃FITC 细胞凋亡检测试剂                    无明显影响（P > 0.05）。miR⁃181d⁃5p的相对表达量
              盒检测细胞凋亡。对于细胞凋亡检测，将细胞消化                            在 siFAT1+IC#1 组显著升高（P < 0.001），在 siNC+
              后，置于 EP 管中，加入试剂盒中的 Annexin V⁃FITC                 miR⁃181d⁃5p inhibitor 组显著下降（P < 0.01），而
              结合液重悬细胞，随后按顺序加入 Annexin V⁃FITC                    siFAT1+miR⁃181d⁃5p inhibitor 组逆转了上述两组对
              和碘化丙啶染色液轻轻混匀，室温避光培养 15 min                        miR⁃181d⁃5p 水平的影响（P < 0.001，图 2B）。FAT1
              左右，利用美国 Beckman Coulter 公司的 CytoFLEX              过表达质粒显著促进了circFAT1的表达（P < 0.001），
              流式细胞仪进行检测。对于周期检测，将细胞消化                            miR⁃181d⁃5p mimic 对 circFAT1 水平无明显影响
              清洗后，加入 70%的乙醇，4 ℃过夜固定；随后加入                        （P > 0.05，图 2C）。miR⁃181d⁃5p 的相对表达量在
              配制好的碘化丙啶工作液37 ℃避光染色30 min，随                       FAT1+MC#1 组显著降低（P < 0.001），在 NC+miR⁃
              后通过流式细胞仪检测分析结果。                                   181d⁃5p mimic 组显著上调（P < 0.001），而 FAT1+
              1.2.6 免疫印迹法（Western blot）检测蛋白水平                   miR⁃181d⁃5p mimic组逆转了上述两组对miR⁃181d⁃5p
                  细胞中加入购自上海碧云天公司的 RIPA裂解                        水平的影响（P < 0.001，图2D）。miR⁃199a⁃5p inhibitor
              液进行裂解，通过 BCA 试剂盒进行蛋白含量测定。                         抑 制 miR⁃199a⁃5p 表 达 ，miR⁃199a⁃5p mimic 促 进
              经过上样电泳及转膜后，将蛋白转移至购自美国                             miR⁃199a⁃5p 表达；miR⁃199a⁃5p 对 circFAT1 表达无
              Thermo Scientific 公司 的 PVDF 膜上；封闭后，加入             影响，但逆转了 circFAT1 对 miR⁃199a⁃5p 表达的调
              相应的一抗和二抗孵育；曝光显影后，以GAPDH 作                         控作用（P < 0.01，图2E~H）。
              为内参对照，分析蛋白表达的相对量。抗体均购买                                 CCK⁃8 显示 siFAT1 抑制了细胞活性，过表达
              自英国 Abcam 公司。英国 Abcam 公司提供的山羊                     circFAT1则相反；miR⁃181d⁃5p inhibitor及miR⁃199a⁃
              抗兔 IgG H&L（HRP）和山羊抗鼠 IgG H&L（HRP）作                5p inhibitor 促进细胞活性，miR⁃181d⁃5p mimic 及
              为二抗。                                              miR⁃199a⁃5p mimic发挥了相反的作用；miR⁃199a⁃5p

              1.3  统计学方法                                        及miR⁃181d⁃5p均逆转circFAT1对细胞活性的调控
                  使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析，计量               作用（P < 0.01，图2I~L）。
              资料以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比较采用                        2.3  circFAT1 通过调控 miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p
              配对样本s检验或独立样本t检验，多组间比较采用                           影响OSCC细胞迁移和侵袭
              单因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。                             Transwell迁移实验结果显示，siFAT1、miR⁃181d⁃
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