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第43卷第2期     陈吉俊，王     梁，马诞骅，等. 环状RNA FAT1（hsa_circ_0001461）通过调控miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p
                  2023年2月         促进口腔鳞状细胞癌进展［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（2）：196-206                    ·197 ·


                miR⁃181d⁃5p inhibitor and miR⁃199a⁃5p inhibitor played the opposing roles（P < 0.05）. MiR⁃181d⁃5p and miR⁃199a⁃5p partially
                reversed the effect of circFAT1 on the biological functions of OSCC cells（P < 0.05）. LY294002 pretreatment reversed the effect of
                overexpression of circFAT1 on PI3K/Akt/mTOR pathway and cell viability（P < 0.05）. Conclusion：circFAT1 promotes the malignant
                progression of OSCC cells by miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p.
               ［Key words］ oral squamous cell carcinoma；hsa_circ_0001461；miR⁃181d⁃5p；miR⁃199a⁃5p；circular RNA
                                                                              ［J Nanjing Med Univ，2023，43（02）：196⁃206］





                    口腔鳞状细胞癌（oral squamous cell carcinoma，         RNA（Si⁃FAT1）、过表达质粒（FAT1）、miR⁃181d⁃5p

                OSCC）是最常见的口腔癌，占所有头颈部癌的 90%                        mimic、miR⁃181d⁃5p inhibitor、miR⁃199a⁃5p mimic、
                                            ［1］
                以上，其患者预后差，病死率高 。OSCC 涉及的分                         miR⁃199a⁃5p inhibitor 以及各自的同型对照（Si⁃NC、
                子发病机制十分复杂，包括多种遗传改变。寻找                             NC、MC、IC）转染到HSC⁃3或SCC⁃25细胞中。mimic
                OSCC潜在的生物标志物，对于疾病的确诊、治疗及                          和inhibitor以及阴性对照购自广州锐博生物科技公
                预后的改善具有十分重要的研究意义。                                 司，siRNA和过表达质粒由上海吉玛基因合成。
                    环状 RNA（circular RNA，circRNA）因高保守性                 为验证目的基因对于PI3K/Akt/mTOR通路的影
                和组织特异性被认为是癌症诊疗有利的候选靶点。                            响，转染前 1 h，向细胞中加入 50 μmol/L LY294002
                本课题组前期已开展OSCC与miR⁃181相关性研究，                      （PI3K/Akt/mTOR 抑制剂）处理。LY294002 购自美
                结果发现miR⁃181d⁃5p与OSCC细胞的生长、迁移和                     国MedChemExpress公司。
                侵袭相关 ；miR⁃199a⁃5p能靶向调控mTOR通路 ，                    1.2.2 实时定量PCR
                                                           ［3］
                        ［2］
                                                           ［4］
                且有报道称其在OSCC中也发挥抑癌因子的作用 。                              使用TRIzol 试剂分别提取OSCC组织和细胞的
                基于前期基础研究、现有文献报道以及数据库分析，                           总 RNA，采用北京全式金生物技术有限公司的
                本研究拟在分析临床患者样本的基础上，结合体外细                           cDNA Synthesis试剂盒合成RNA逆转录后产物。利
                胞实验，探讨circFAT1在OSCC中的作用，并初步了解                     用美国 Applied Biosystems 公司的实时荧光定量
                其与miR⁃181d⁃5p/miR⁃199a⁃5p的关系。                     PCR 仪器和 SYBR Green Supermix 试剂进行实时定
                                                                  量 PCR以检测circFAT1、miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p
                1  对象和方法
                                                                  在OSCC 组织和细胞中表达量。GAPDH 和 U6 分
                1.1  对象                                           别 作 为 内 参 基 因 。 利 用 2     - ΔΔ Ct  法 分 析 circFAT1、
                    选取 2021 年 1 月—2021 年 10 月在本院接受手               miR⁃181d⁃5p、miR⁃199a⁃5p的相对表达量。
                术治疗的 OSCC 患者 30 例。收集临床组织样本，包                          引物序列如下：circFAT1（5′⁃AACAGAAGAGA⁃
                括癌组织和癌旁组织，均经过病理学验证。纳入标                            ACTGGGGCG⁃3′，5′⁃GATCAGGGTGCCAATGGTGA⁃
                准：①患者病理诊断经 3 位病理科医生核实确诊为                          3′）；GAPDH（5′⁃TGTTCGTCATGGGTGTGAAC⁃3′，5′⁃
                OSCC；②患者术前均没有接受放化疗。排除标准：                          ATGGCATGGACTGTGGTCAT⁃3′）；miR⁃181d⁃5p（5′⁃
                ①存在其他全身系统性疾病；②术前接受其他抗肿                            AACATTCATTGTTGTCGGTGGGTG⁃3′，5′⁃TCGTAT⁃
                瘤治疗。本研究方案获得院伦理委员会批准，患者                            CCAGTGCGTGTCG⁃3′）；miR⁃199a⁃5p（5′⁃CCAGT⁃
                均签署了知情同意书。                                        GTTCAGACTACCTGTTC⁃3′，5′⁃GTA⁃TCCAGTGCGT⁃

                1.2  方法                                           GTCGTGG⁃3′）；U6（5′⁃CTCGCTTCGGCAGCACA⁃3′；
                1.2.1 细胞培养、转染及处理                                  5′⁃AACGCTTCACGAATTTGCGT⁃3′）。
                    正常口腔角质形成细胞系 hNOK（上海通派生                        1.2.3 靶基因关系的预测和验证
                物科技有限公司），OSCC细胞SCC⁃25、CAL⁃27（美国                       将 circFAT1 的野生型或突变型序列重组到双

                模式培养物研究所），HSC⁃2、HSC⁃3（Riken Cell                  荧光素酶报告载体 pmirGLO 中构建双荧光素酶质
                Bank，日本）。所有细胞培养在含有 10%的胎牛血                        粒（FAT1⁃wt 或 FAT1⁃mut）。SCC⁃25 和 HSC⁃3 细胞

                清及 1% 双抗的 DMEM 培养基中，并放在 37 ℃、5%                   在完全培养基中培养并用 miR⁃181d⁃5p mimic 或
                CO2 的恒温培养箱中。根据美国 Invitrogen 公司的                   miR⁃199a⁃5p mimic和双荧光素酶重组质粒共转染，
                Lipofectamine 3000 的 说 明 书 将 circFAT1 小 干 扰       以 mimic control（MC#1，MC#2）作为对照。 随后，使
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