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第43卷第2期
               ·208 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年2月


              全成熟化的组织，如囊性病变；③肾脏发育不全，肾                           定，取出冲洗后脱水，组织包埋切片，对石蜡切片进
                                                  ［2］
              脏含有较少的肾单位和/或肾脏体积缩小 。                              行免疫组化。载玻片用二甲苯脱蜡，然后在乙醇中
                  RHD致病机制复杂，涉及多种基因突变或者信                         连续脱水，蒸馏水浸洗。在0.1 mol/L 柠檬酸修复液
              号通路异常     ［3-4］ 。目前，约 40 个 CAKUT 致病基因已            （pH6）中，中高火加热玻片 30 min 进行抗原修复。
                                               ［5］
              被确定，解释了 5％~20％的患者病因 。另外大约                         在 3% H2O2中室温避光孵育 10 min，阻断内源性过
              16％的病例被确定为基因拷贝数变异导致，其中                            氧化物酶活性，PBS（pH7.4）浸洗 3 次，每次 5 min。
              研究比较多的是 17 号染色体上的 HNFB1 基因座                       将载玻片封闭在 3% BSA 溶液中，置于湿盒中室温
              与 22 号 染 色 体 上 的 Di ⁃ George 综 合 征 区 域     ［6］ 。  孵育 30 min。而后甩掉封闭液，滴加一抗工作液均
              16p11.2 基因座是 CAKUT 研究热点区域，与全面发                    匀覆盖组织，使载玻片在一抗中4℃孵育过夜。第2
              育迟缓、畸形、癫痫等相关，部分患者表现出肾脏                            天取出切片室温复温30 min，润洗后，滴加与一抗对
                                  ［7］
              畸形或其他肾脏疾病 。该区域的喹啉磷酸核糖                             应的即用型快捷免疫组化 MaxVision HRP 二抗覆
                                                                                                  TM
              基 转 移 酶（quinolinic phosphoribosyl transferase，    盖组织，在室温下持续 30 min。再次润洗，用 DAB
              QPRT）基因在肾脏组织中的表达最高，但其对胎                           过氧化物酶底物试剂盒进行显色，苏木素复染。连
              儿肾脏发育的影响尚不明确。                                     续脱水待干后，中性树脂封片。
                  本研究利用免疫组化在胎鼠肾脏组织中对                            1.2.2 基因敲除小鼠模型建立及表型鉴定
              QPRT基因定位，并进一步构建了QPRT基因敲除小                              CRISPR/Cas9 技术构建 QPRT 基因敲除小鼠模
              鼠模型，观察小鼠及其子代肾脏病理组织学及肾功                            型：由南京大学模式动物研究所订购QPRT Cas9⁃KO
              能变化，探讨QPRT基因缺陷对肾脏发育的影响，为                          斑点鼠（-4 321 bp/wt，E2-E4 完全删除，KO 阳性，
              挖掘RHD新致病基因提供新证据。                                  5.43周龄），得到嵌合体F0代小鼠。
                                                                     QPRT 基因敲除小鼠的饲养和繁殖：将 F0 代中
              1  材料和方法
                                                                所有小鼠饲养于 SPF 级环境中，提供充足的食物与
              1.1  材料                                           可饮用水。通过 PCR 及 TA 克隆测序分析，从所有
                  实验采用的动物均为 C57BL/6JGpt 品系背景，                   的F0代小鼠中挑选出QPRT 基因缺失的小鼠，然后
              QPRT基因敲除的F0代小鼠购自南京大学南京生物                          将性成熟的阳性 F0 代小鼠（满 8 周）分别与同龄的
              医药研究所，于淮安市第一人民医院无特定病原体                            C57BL/6J 小鼠交配，培育后成功获得 F1 代小鼠，继
             （specific pathogen free，SPF）级环境中饲养及配繁，动            续将F1代小鼠在SPF环境中饲养，再将性成熟的F1
              物饲养环境严格保证温度为 18~22 ℃、相对湿度为                        代雌雄小鼠相互杂交，杂交后的每只F1代孕鼠单独
              40%~70%且明暗交替时间12 h/12 h（07：00⁃19：00），             饲养、培育，得到F2代小鼠。
              喂养灭菌水和 SPF 级繁殖鼠料，自由进食水。取                               基因型鉴定：同一父母产生的后代小鼠中包含野
              E13 胎鼠肾脏组织，用免疫组织化学（immunohisto⁃                   生型（WT）、杂合型（HT）和基因敲除型（KO）3种基因
              chemistry，IHC）检测 QPRT 基因在肾脏中的表达。                  型。采用剪脚趾法标记小鼠，并剪取鼠尾组织经酚氯
              本研究经南京医科大学实验动物福利伦理委员会                             仿法提取DNA，依据表格1中在靶区域设计的引物进
              批准［批准文号：南医大伦审（YX⁃2⁃2022⁃021⁃01                    行扩增，于 1.5%琼脂糖凝胶上加入 PCR 扩增产物
              号］，所有实验动物的操作与饲养均符合国标及江苏                           5 μL，DNA Marker 3 μL，电泳30 min后通过凝胶成像
              省实验动物中心管理饲养条例，符合伦理规范要求。                           仪获取条带，凝胶分析系统进行分析。基因型鉴定
                  QPRT 引物由南京大学南京生物医药研究所设                        后筛选出WT型和KO型小鼠。
              计，引物及琼脂糖粉末购自生工生物工程（上海）股                                Western blot 检测 QPRT 蛋白表达：处死小鼠后

              份 有 限 公 司 ，QPRT 引 物 序 列 如 表 1。 正 义 5′ ⁃           取肾脏组织，加入蛋白裂解液提取蛋白。蛋白定量
              GAAGGGCAAACCATTAAGAGAAGC ⁃ 3′ ，反 义 5′ ⁃           后，加入 5×上样缓冲液配成样品，90 ℃水浴 10 min
              GCAGTAACAGCAATCCTGTGGAAG⁃ 3′，引物长度                 使蛋白变性，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转膜至
              24 bp，产物长度256 bp，退火温度65 ℃。                        PVDF 膜上，用 5%脱脂奶粉溶液封闭 2 h，加入相应

              1.2  方法                                           的一抗，4 ℃过夜孵育，加入对应的二抗，室温孵2 h，
              1.2.1  QPRT在胎鼠肾脏组织的表达                             ECL发光显色，成像分析。
                  取 E13 胎鼠肾脏组织，用 4%多聚甲醛过夜固                           称重法、肾功能检测、HE染色实验方法：初步分
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