Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期
·454 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年4月

离心15 min，收集蛋白上清。蛋白质通过10%、15% 3~5 min 后自然流水缓慢冲洗玻片 5 min；最后滴加
SDS⁃PAGE 分离并电泳转移到 PVDF 膜上。在室温 苏木素染色 20~30 s，流水洗净，自然晾干后显微镜
（23±2）℃下用5%脱脂牛奶封闭膜1.5 h。将一抗在 下观察拍照。
4 ℃下孵育过夜。用 PBST 洗涤膜 3 次，每次 10 min 1.2.5 ELISA检测蛋白表达
后，将膜与二抗在室温下孵育2 h。最后，用PBST洗 用蛋白裂解液 RIPA 和蛋白酶抑制剂 PMSF 研
涤膜 3 次，每次 10 min，并通过 Bio⁃Rad 成像系统检 磨小鼠结肠组织，冰上裂解30 min后，4 ℃、12 000 g
测信号。 离心 15 min，收集蛋白上清。根据实验步骤，利用
1.2.4 AB⁃PAS糖原染色 BCA 试剂盒对组织蛋白浓度进行定量。使用小鼠
小鼠结肠石蜡切片于 65 ℃烘箱中烘烤 1~2 h， IL⁃25、IL⁃4、IL⁃10、TNF⁃α及 IFN⁃γ ELISA 试剂盒测
放入二甲苯中脱蜡 0.5 h，依次将玻片放入 95%乙 定结肠中的IL⁃25、IL⁃4、IL⁃10、TNF⁃α及IFN⁃γ水平。
醇、70%乙醇、30%乙醇、蒸馏水中 10 min 进行水 1.2.6 Real⁃time PCR检测
化。参照AB⁃PAS染色实验步骤 ［12］ 对结肠组织进行 取部分小鼠结肠组织，参照RNA提取试剂盒进
染色：蒸馏水稍洗样本，滴加阿利新蓝染色液染色 行总 RNA 的提取，按照逆转录试剂盒说明书将总
10~20 min，水洗 10 s；将过碘酸雪夫染液滴加在玻 RNA 逆转录成 cDNA。根据说明书进行 Real⁃time

片样本上，全部覆盖，水平放置，室温孵育 10 min PCR检测，检测程序为：第1阶段，94 ℃，30 s；第2阶
后蒸馏水冲洗玻片 2~3 min；玻片未完全干透之前， 段：94 ℃，5 s，55 ℃，15 s，72 ℃，10 s，重复 42 个循
滴加雪夫试剂于玻片样本上，均匀覆盖，室温孵育 环。实验所用引物序列见表1。

表1 Real⁃time PCR引物序列
Table 1 Primer sequences used for real⁃time PCR
基因 上游序列（5′→3′） 下游序列（5′→3′）
β⁃actin GGCTGTATTCCCCTCCATCG CCAGTTGGTAACAATGCCATGT
Ifn⁃γ GGCACAGTCATTGAAAGCCTA ATTCAATGACGCTTATGTTGT
Tnf⁃α CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA TGGGAGTAGACAAGGTACAACCC
Il⁃1β GCAACTGTTCCTGAACTCAACT ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT
Il⁃4 ACAGGAGAAGGGACGCCAT GAAGCCCTACAGACGAGCTCA
Il⁃10 ACTTTAAGGGTTACTTGGGTTGC ATTTTCACAGGGGAGAAATCG
Il⁃13 TCCAACTCCAAGATTTCCCCG CATGCAGTAGACATGGCAGA

1.3 统计学方法 2.2 外源性IL⁃25对日本血吸虫感染导致的肝脏损
本研究中所有数据均采用 GraphPad Prism 8.0 伤无显著影响
统计软件进行统计学分析，实验数据以均数±标准 在感染日本血吸虫 6 周后，对各组小鼠肝脏进
误（x ± sx ）表示，两组间比较采用t检验，多组间比较 行拍照并称重，结果显示，相比正常组及正常+IL⁃25
采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法。P < 组，感染组及感染+IL⁃25组小鼠肝脏体积增大、肝脏
0.05为差异有统计学意义。 体重比值增加，但是感染组与感染+IL⁃25 组小鼠肝
脏/体重比无明显差别（P=0.337，图2A、B）。
2 结 果
对感染组、感染+IL⁃25 组小鼠肝脏进行 HE 染
2.1 日本血吸虫感染后，小鼠结肠出现虫卵堆积且 色，观察虫卵堆积及肉芽肿情况。肝脏 HE 结果显
IL⁃25含量显著降低 示，感染组及感染+IL⁃25 组小鼠肝脏均出现虫卵堆
在感染日本血吸虫 6 周后，对小鼠结肠标本进 积并伴随肉芽肿（图2C），两组间单个肉芽肿面积大
行 HE 染色，观察虫卵堆积及肉芽肿面积情况。结 小并没有显著区别（P=0.105，图2D）。
果显示，相比正常组，感染组小鼠结肠出现明显虫 2.3 IL⁃25缓解日本血吸虫感染引起的小鼠结肠损伤
卵堆积并伴随肉芽肿（图 1A）。Western blot 实验结 在感染日本血吸虫 6 周后，对各组小鼠结直肠
果显示，日本血吸虫感染后小鼠结肠中 IL⁃25 含量 进行拍照并测量其长度，结果显示，正常组、正
显著低于正常组（P < 0.01，图1B、C）。 常+IL⁃25 组、感染组及感染+IL⁃25 组小鼠结直肠长