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第43卷第4期 李 玉，应 帅，葛 文，等. HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修
2023年4月 饰位点的鉴定［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：445-451 ·449 ·

2.4 TRAF6经K63连接的多聚泛素化修饰KLF5相 氨酸位点突变后，KLF5 K63 连接的多聚泛素化水
应的赖氨酸 平显著降低（图 5A~C）。此外，保守性分析结果显
为了鉴定 TRAF6 经 K63 连接的多聚泛素化修 示，不同物种的 KLF5 氨基酸序列在 K99 和 K100 位
饰KLF5的相应赖氨酸位点，将KLF5赖氨酸位点突 点均呈高度保守状态（图 5D）。以上结果提示，
变质粒分别与 TRAF6 和 Ub 质粒共转染至 293T 细 KLF5 K99 和 K100 赖氨酸为 KLF5 的多聚泛素化修
胞 48 h。IP/IB 实验发现，只有 KLF5 K99 和 K100 赖 饰位点。

A B
K387/390R
WT K31R K52R K83R K99R K100R K141R K151R WT K199R K262R K321R K355R K368/372/77R K412/417R

IP：HA/IB：Ub k63 IP：HA/IB：Ub k63

50 kDa IP：HA/IB：HA 50 kDa IP：HA/IB：HA
48 kDa IP：HA/IB：Flag 48 kDa IP：HA/IB：Flag
50 kDa IB：HA 50 kDa IB：HA
WCL WCL
48 kDa IB：Flag 48 kDa IB：Flag

WT K439R
C D

IP：HA/IB：Ub k63
Rattus norvegicus（Norway rat） 091 pvpiiseh kk yrrdsasvvd 110
Homo sapiens（human） 011 pvpiipeh kk yrrdsasvvd 30
Mus musculus（house mouse） 091 pvpiisch kk yrrdsasvvd 110
50 kDa IP：HA/IB：HA
Pan troglodytes（chimpanzee） 011 pvpiipeh kk yrrdsasvvd 30
48 kDa IP：HA/IB：Flag Sus scrofa（pig） 101 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 120
Bos taurus（cattle） 011 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 30
50 kDa IB：HA Equus caballus（horse） 011 pvsiipch kk yrrdsasvvd 30
WCL
48 kDa IB：Flag Felis catus（domestic cat） 011 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 30

A~C：将Flag⁃TRAF6质粒和Ub质粒分别与不同KLF5赖氨酸位点突变质粒（A：KLF5赖氨酸位点K31~K151的突变；B：KLF5 赖氨酸位点
K199~K417 的突变；C：KLF5 赖氨酸位点 K439 的突变）共转染 293T 细胞 48 h，然后进行 IP/IB 检测；D：不同物种 KLF5 氨基酸序列在 K99 和
K100处高度保守。
图5 TRAF6介导的 K63位多聚泛素化修饰KLF5赖氨酸（位点）的鉴定
Figure 5 The lysine（site）identification of KLF5 K63⁃linked polyubiquitination mediated by TRAF6

2.5 KLF5 K99 或 K100 及 K99/K100 联合突变可下 modification，PTM）的一种形式，是由E1、E2和E3泛
调KLF5 K63位多聚泛素化修饰 素酶活化、结合和连接三步级联反应将Ub分子连接
为了确证 KLF5 的 K99 或 K100 单个位点突变 到底物上的过程 ［10］ ，其中E3泛素连接酶能催化Ub，
以及K99与K100联合突变能对KLF5 K63连接的多 通过其C端甘氨酸与底物蛋白的赖氨酸残基之间形
聚泛素化修饰产生影响，我们分别将 KLF5 WT 或 成异肽键和共价结合，并借此调控靶蛋白的功能或
［11］
K99、K100、K99/K100 联合突变的质粒与 TRAF6 和 命运 。
Ub 质粒共转染至 293T 细胞并进行 IP/IB 检测。结 TRAF6是一种兼有E3连接酶活性的功能分子，
果发现，KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平均显著 能对多种蛋白进行不同类型的泛素化修饰，进而参
下降，但以转染 KLF5 的 K99/K100 联合突变质粒的 与疾病的发生与发展 ［11，13］ 。有文献报道，TRAF6 可
细胞下降更为明显（图6）。 经 K48 或 K63 连接的方式多聚泛素化修饰转录因

子，K48 连接的多聚泛素化能使蛋白被招募到 26S
3 讨 论
蛋白酶体进行降解，而 K63 连接的多聚泛素化则不
泛素化是蛋白质翻译后修饰（post⁃translational 降解蛋白，但可激活转录因子的活性 ［13- 15］ 。已知