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第43卷第4期 李 玉,应 帅,葛 文,等. HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修
2023年4月 饰位点的鉴定[J]. 南京医科大学学报(自然科学版),2023,43(04):445-451 ·449 ·
2.4 TRAF6经K63连接的多聚泛素化修饰KLF5相 氨酸位点突变后,KLF5 K63 连接的多聚泛素化水
应的赖氨酸 平显著降低(图 5A~C)。此外,保守性分析结果显
为了鉴定 TRAF6 经 K63 连接的多聚泛素化修 示,不同物种的 KLF5 氨基酸序列在 K99 和 K100 位
饰KLF5的相应赖氨酸位点,将KLF5赖氨酸位点突 点均呈高度保守状态(图 5D)。以上结果提示,
变质粒分别与 TRAF6 和 Ub 质粒共转染至 293T 细 KLF5 K99 和 K100 赖氨酸为 KLF5 的多聚泛素化修
胞 48 h。IP/IB 实验发现,只有 KLF5 K99 和 K100 赖 饰位点。
A B
K387/390R
WT K31R K52R K83R K99R K100R K141R K151R WT K199R K262R K321R K355R K368/372/77R K412/417R
IP:HA/IB:Ub k63 IP:HA/IB:Ub k63
50 kDa IP:HA/IB:HA 50 kDa IP:HA/IB:HA
48 kDa IP:HA/IB:Flag 48 kDa IP:HA/IB:Flag
50 kDa IB:HA 50 kDa IB:HA
WCL WCL
48 kDa IB:Flag 48 kDa IB:Flag
WT K439R
C D
IP:HA/IB:Ub k63
Rattus norvegicus(Norway rat) 091 pvpiiseh kk yrrdsasvvd 110
Homo sapiens(human) 011 pvpiipeh kk yrrdsasvvd 30
Mus musculus(house mouse) 091 pvpiisch kk yrrdsasvvd 110
50 kDa IP:HA/IB:HA
Pan troglodytes(chimpanzee) 011 pvpiipeh kk yrrdsasvvd 30
48 kDa IP:HA/IB:Flag Sus scrofa(pig) 101 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 120
Bos taurus(cattle) 011 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 30
50 kDa IB:HA Equus caballus(horse) 011 pvsiipch kk yrrdsasvvd 30
WCL
48 kDa IB:Flag Felis catus(domestic cat) 011 pvsiipeh kk yrrdsasvvd 30
A~C:将Flag⁃TRAF6质粒和Ub质粒分别与不同KLF5赖氨酸位点突变质粒(A:KLF5赖氨酸位点K31~K151的突变;B:KLF5 赖氨酸位点
K199~K417 的突变;C:KLF5 赖氨酸位点 K439 的突变)共转染 293T 细胞 48 h,然后进行 IP/IB 检测;D:不同物种 KLF5 氨基酸序列在 K99 和
K100处高度保守。
图5 TRAF6介导的 K63位多聚泛素化修饰KLF5赖氨酸(位点)的鉴定
Figure 5 The lysine(site)identification of KLF5 K63⁃linked polyubiquitination mediated by TRAF6
2.5 KLF5 K99 或 K100 及 K99/K100 联合突变可下 modification,PTM)的一种形式,是由E1、E2和E3泛
调KLF5 K63位多聚泛素化修饰 素酶活化、结合和连接三步级联反应将Ub分子连接
为了确证 KLF5 的 K99 或 K100 单个位点突变 到底物上的过程 [10] ,其中E3泛素连接酶能催化Ub,
以及K99与K100联合突变能对KLF5 K63连接的多 通过其C端甘氨酸与底物蛋白的赖氨酸残基之间形
聚泛素化修饰产生影响,我们分别将 KLF5 WT 或 成异肽键和共价结合,并借此调控靶蛋白的功能或
[11]
K99、K100、K99/K100 联合突变的质粒与 TRAF6 和 命运 。
Ub 质粒共转染至 293T 细胞并进行 IP/IB 检测。结 TRAF6是一种兼有E3连接酶活性的功能分子,
果发现,KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平均显著 能对多种蛋白进行不同类型的泛素化修饰,进而参
下降,但以转染 KLF5 的 K99/K100 联合突变质粒的 与疾病的发生与发展 [11,13] 。有文献报道,TRAF6 可
细胞下降更为明显(图6)。 经 K48 或 K63 连接的方式多聚泛素化修饰转录因
子,K48 连接的多聚泛素化能使蛋白被招募到 26S
3 讨 论
蛋白酶体进行降解,而 K63 连接的多聚泛素化则不
泛素化是蛋白质翻译后修饰(post⁃translational 降解蛋白,但可激活转录因子的活性 [13- 15] 。已知