Page 8 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第4期
               ·446 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年4月


                  系膜增生性肾小球肾炎（mesangial proliferative            机制奠定了重要的的实验基础。
              glomerulonephritis，MsPGN）是人类发病率较高的肾               1 材料和方法
              小球疾病（如 IgA 型肾病），其病理特征是肾小球系
              膜细胞（glomerular mesangial cell，GMC）的异常增生           1.1  材料
              及细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的过度分                    人胚肾 293T（HEK 293T，简称 293T）细胞由武
              泌，患者可因肾功能衰竭而死亡               ［1-2］ 。大鼠 Thy⁃1 肾    汉大学中国典型培养物保藏中心提供。Lipofectamine
              炎（Thy⁃1 nephritis，Thy⁃1N）是研究MsPGN的公认模             2000 来源于美国赛默飞世尔科技公司；抗⁃HA tag
                                             ［3］
              型，其肾脏病变与MsPGN极为相似 。已有研究发                          抗体由武汉三鹰生物技术有限公司提供；抗⁃Ub
              现，不论是人的 MsPGN，还是大鼠的 Thy⁃1N，其                      （linkage⁃specific K63）抗体购于美国 Abcam 公司；

                                                                                           ®
              GMC表面均有补体C5b⁃9复合物的沉积，且此C5b⁃9                      抗⁃DDDDK tag（Binds to FLAG tag sequence）抗体和
              多为亚溶解（sublytic）型     ［3-5］ 。已有文献报道，sublytic       抗⁃Ub（linkage⁃specific K48）抗体由武汉爱博泰克
              C5b⁃9是诱发Thy⁃1N大鼠GMC病变的始动原，体外                      生物有限公司提供；小鼠β⁃actin 单克隆抗体及免疫
              用 sublytic C5b⁃9 刺激 GMC 后能导致细胞的增生和                沉淀（immunoprecipitation，IP）和 IP 细胞裂解液来
              ECM的分泌等      ［6-7］ 。                              源于上海碧云天生物公司；羊抗兔、鼠 IgG⁃HRP
                  众所周知，细胞受到刺激后能开启多条信号通                          二 抗 购 于合肥 Biosharp 公司；MG⁃132 购自美国
              路，激活或上调某些信号分子、转录因子和蛋白酶                            MedChemExpress 公司；NheⅠ酶、EcoRⅠ酶、SalⅠ酶
              类等，调控相应靶基因的转录与表达，最终促使细                            和BamHⅠ酶由日本TaKaRa公司供应。HA⁃KLF5、
              胞生物学行为发生改变            ［7-8］ 。就 Thy⁃1N 而言，本课       Flag⁃TRAF6 和 HA⁃KLF5 的所有赖氨酸位点突变质
              题组以往的研究已证实，在Thy⁃1N大鼠发病的肾组                         粒由安徽通用公司构建；shTRAF6、TRAF6 C70A 和
              织（体内）和受sublytic C5b⁃9刺激的GMC（体外）中，                 泛素（ubiquitin，Ub）质粒均由南京医科大学免疫学
              众多信号分子、转录因子和促增生分子显著上调                     ［5-8］ ，  系邱文教授提供。
              其中肿瘤坏死因子受体相关因子 6（tumor necrosis                   1.2  方法
                                                 ［9］
              factor receptor⁃associated factor 6，TRAF6） 和Krüppel  1.2.1  293T细胞的培养
              样因子 5（Krüppel⁃like factor 5，KLF5） 升高明显，                将293T细胞接种于DMEM 完全培养液（含10%
                                                ［8］
              且具有一定的促炎和促增生效应。                                   胎牛血清）中，置37 ℃、5% CO2孵箱中培养48 h。当细
                  TRAF6 是一个兼有 E3 泛素连接酶活性的多功                     胞融合度达到80%以上时，按1∶4比例进行传代培养。
              能分子，能泛素化修饰多种因子进而调控疾病的过                            1.2.2  质粒测序鉴定与细胞转染
              程 ［10］ ，其机制涉及 TRAF6 作用底物的方式，如泛素                        首先，将安徽通用公司构建的所有带有GFP 标
              分子 K63 或 K48 连接的多聚泛素化修饰，前者能提                      签的质粒进行酶切、琼脂糖电泳和 DNA 测序，测序
              高底物的活性，而后者则可降解底物蛋白                       ［10- 11］ 。  结果行BLAST比对鉴定。在明确质粒构建成功后，
              KLF5 属于含锌指结构的转录因子，其表达升高可                          先将培养的293T细胞接种到6孔板，待其融合度达
              诱导靶基因的转录与表达             ［12］ 。本课题前期验证性            80%以上时进行质粒的细胞转染，即用 DMEM 稀释
              实验已确定，Thy⁃1N 大鼠发病 3 h 的肾组织和用                      Lipofectamine 2000 和待转染的质粒，静置 5 min 后
              sublytic C5b⁃9刺激3 h的GMC中，TRAF6和KLF5的              将两者混合，再静置 15 min 后加入 293T 细胞，置
              表达均显著升高（达到峰值）。该结果提示，同步上                           37 ℃、5% CO 2条件下继续培养48 h。用荧光显微镜
              调的TRAF6和KLF5之间或许有着某种联系。                           观察质粒的转染效率。
                  为了明确 TRAF6 与 KLF5 是否存在相互结合，                   1.2.3  IP实验
              以及TRAF6能否通过其相应的修饰方式（K63/K48）                           将 HA⁃KLF5 和 Flag⁃TRAF6 共转染 293T 细胞
              多聚泛素化修饰 KLF5，本研究体外利用工具细胞                          48 h 后，加入 IP 裂解缓冲液（含蛋白酶抑制剂），冰
              HEK 293T（即 293T）观察了 TRAF6 与 KLF5 的结合              上裂解细胞30 min，12 000 r/min离心30 min后吸取
              及 KLF5 被 TRAF6 多聚泛素化修饰的情况，并对                      上清，同时取少量全细胞裂解液作为 Input，剩余裂
              TRAF6 多聚泛素化修饰 KLF5 的位点进行了鉴定。                      解液中加入 1 μg 抗⁃Flag tag 抗体或抗⁃HA tag 抗体
              本研究为今后进一步深入探讨TRAF6与KLF5的关                         和80 μL protein A/G⁃beads（IgG为阴性对照），4 ℃摇
              系及 TRAF6 多聚泛素化修饰调控 Thy⁃1N 的作用和                    晃孵育过夜。之后，4 ℃，3 000 r/min 离心 5 min，弃
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