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第43卷第4期 李 玉，应 帅，葛 文，等. HEK 293T细胞中TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及其修
2023年4月 饰位点的鉴定［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：445-451 ·447 ·

去上清，将管底的 protein A/G⁃beads 用 1 mL 裂解缓 Flag⁃TRAF6 和 HA⁃KLF5 质粒均构建成功（图 1）。
冲液洗3~4次。最后加50 μL的蛋白Loading buffer， 之后，将 Flag⁃TRAF6 和 HA⁃KLF5 质粒共转染至
沸水煮7 min，12 000 r/min离心5 min，保存于-20 ℃ 293T细胞48 h，观察表达GFP的细胞占总293T细胞
用于后续免疫印迹（immunoblotting，IB）实验。 的百分比。结果显示，质粒转染 GMC 48 h 后，转染
1.2.4 IB实验 效率可达到70%以上。
取等量（30 μg/泳道）IP得到的蛋白裂解物分别
进行 SDS⁃PAGE 凝胶电泳 2 h。用湿转法将蛋白转
Flag⁃TRAF6
HA⁃KLF5
印到PVDF 膜上（0.3 A，120 min）。之后，用5％脱脂 Digested HA⁃KLF5 Digested Flag⁃TRAF6
牛奶室温封闭 2 h，再加入相应的一抗，4 ℃孵育过 Marker Marker
夜。TBST 液漂洗 3 次（每次 10 min）后加入 HRP 标
记的二抗，室温孵育 1 h，用 ECL 化学发光检测。最
后对比内参β⁃actin，行半定量分析。
1.2.5 多聚泛素化水平的检测

将Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5与Ub质粒或与shTRAF6
或TRAF6 C70A质粒共转染293T细胞36 h后，再用 HA⁃KLF5或Flag⁃TRAF6质粒双酶切后琼脂糖凝胶电泳的条带。
10 μmol/L MG132 处理 12 h。用含蛋白酶抑制剂 图1 HA⁃KLF5和Flag⁃TRAF6质粒的鉴定
Figure 1 The identification of HA⁃KLF5 and Flag⁃RAF6
的 IP 裂解缓冲液处理细胞，裂解细胞后 30 min 行
plasmids
12 000 r/min 离心 30 min，其余 IP 和 IB 操作步骤同
上 1.2.3 和 1.2.4 所述。最后以 HA tag 定量目的蛋 2.1.2 293T细胞中TRAF6可与KLF5结合
白，检测其多聚泛素化的修饰水平。 为了检查 TRAF6 与 KLF5 能否结合，我们将
1.3 统计学方法 Flag⁃TRAF6与HA⁃KLF5表达质粒共转染至293T细
采用SPSS 19.0进行统计统计学分析，所有实验 胞后48 h，分别用抗 HA 抗体和抗Flag抗体进行IP，
均独立重复3次，所得定量数据以均数±标准误（x ± s， 之后再行相应的 IB 实验。结果发现，TRAF6 与
x）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两两比较 KLF5存在相互结合（图2）。
采用Bonfferoni法。P < 0.05为差异有统计学意义。 2.2 293T 细胞中过表达或沉默 TRAF6 对 KLF5 多
聚泛素化修饰的影响
2 结 果
为了确定TRAF6是否对KLF5进行多聚泛素化
2.1 293T细胞中TRAF6与KLF5存在作用 修饰并明确其泛素化修饰的方式，我们将HA⁃KLF5
2.1.1 Flag⁃TRAF6和HA⁃KLF5质粒测序正确 和Ub质粒与Flag⁃TRAF6质粒共转染293T细胞48 h
将公司构建的 Flag⁃TRAF6 和 HA⁃KLF5 质粒进 进行检测。结果表明，过表达 TRAF6 增加了 KLF5
行酶切电泳和 DNA 测序，经 BLAST 比对后证实，目 K63连接的泛素化水平，但其对KLF5 K48连接的泛
的DNA片段已正确插入pIRES⁃EGFP载体中。表明 素化修饰无明显影响（图3）。此外，将HA⁃KLF5、Ub

A HA IgG B Flag
IP： IP： IP： IP： IgG
HA⁃KLF5 + +
HA⁃KLF5 + +
Flag⁃TRAF6 + +
Flag⁃TRAF6 + +
48 kDa IB：Flag 50 kDa IB：HA
50 kDa IB：HA 48 kDa IB：Flag
48 kDa IB：Flag 50 kDa IB：HA
WCL WCL
50 kDa IB：HA 48 kDa IB：Flag
A：用HA标签抗体行IP/IB检测显示，HA⁃KLF5与 Flag⁃TRAF6存在结合；B：用Flag标签抗体行IP/IB检测发现，Flag⁃TRAF6与HA⁃KLF5也
存在结合。
图2 293T细胞中外源性TRAF6与KLF5相互结合的检测
Figure 2 The binding detection between exogenous TRAF6 and KLF5 in 293T cells