Page 10 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期
·448 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年4月

和Flag⁃TRAF6质粒与shTRAF6质粒共转染293T细 K63连接的泛素化水平，且对KLF5 K48连接的泛素
胞 48 h 时发现，沉默 TRAF6 基因可明显降低 KLF5 化修饰无明显影响（图3）。

A HA IgG B
IP： IP：
HA⁃KLF5 + + + +
Flag⁃TRAF6 - + + +
shTRAF6 - - + +
**
Ub + + + + 4
MG132 + + + + 3 ** K63
泛素化 相对表达水平 2 K48

IB：Ub k63 1 0

HA⁃KLF5 + + +
Flag⁃TRAF6 - + +
IB：Ub k48 shTRAF6 - - +
Ub + + +
MG132 + + +
50 kDa IB：HA
48 kDa IB：Flag
50 kDa IB：HA
WCL
48 kDa IB：Flag
将Flag⁃TRAF6、shTRAF6、HA⁃KLF5及Ub质粒共转染293T细胞48 h，IP/IB检测KLF5 K63和K48连接的泛素化水平。A：IB条带；B：半定
量分析，两组比较，P < 0.01（n=3）。
**
图3 过表达或沉默TRAF6对KLF5不同多聚泛素化修饰（K63和K48）的影响
Figure 3 The effect of TRAF6 overexpression or knockdown on KLF5 K63/K48⁃linked polyubiquitination level

2.3 TRAF6 的 E3 泛 素 连 接 酶 活 性 缺 失 可 影 响 C70A突变体（即第70位半胱氨酸突变为丙氨酸）质
KLF5 K63位多聚泛素化修饰 粒共转染 293T 细胞 48 h。IP/IB 结果显示，TRAF6
为了确定 KLF5 K63 连接的多聚泛素化是否依 WT 可增加KLF5 K63连接的多聚泛素化，而酶催化
赖于TRAF6 E3泛素连接酶活性，我们将HA⁃KLF5、 活性缺失的 TRAF6 C70A 突变体对 KLF5 K63 连接
Ub 质粒与 Flag⁃TRAF6 野生型（WT）质粒或 TRAF6 的多聚泛素化修饰无明显影响（图4）。

A HA IgG B
IP： IP：
HA⁃KLF5 + + + +
Flag⁃TRAF6 - + - + 2.5 **
K63位泛素化 相对表达水平
Flag⁃TRAF6 C70A - - + + 2.0 **
Ub + + + + 1.5
MG132 + + + + 1.0
0.5
0
IP：HA IB：Ub k63 HA⁃KLF5 + + +
Flag⁃TRAF6 - + -
Flag⁃TRAF6 C70A - - +
50 kDa IP：HA IB：HA Ub + + +
48 kDa IP：HA IB：Flag MG132 + + +
50 kDa IB：HA
WCL
48 kDa IB：Flag
将Flag⁃TRAF6、Flag⁃TRAF6 C70A、HA⁃KLF5及Ub质粒共转染293T细胞48 h，然后进行IP/IB检测。A：IB条带；B：半定量分析，两组比较，
P < 0.01（n=3）。
**
图4 TRAF6酶活性缺失对KLF5 K63连接的多聚泛素化修饰的影响
Figure 4 The effect of the TRAF6 enzyme activity deficiency on KLF5 K63⁃linked polyubiquitination