Page 7 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期 南京医科大学学报（自然科学版）
2023年4月 Journal of Nanjing Medical University（Natural Sciences） ·445 ·

·基础研究·

HEK 293T 细胞中 TRAF6 多聚泛素化修饰 KLF5 的方式及其修

饰位点的鉴定

李 玉，应 帅，葛 文，阮玉婷，吴宁霞，王伟民，张 婧，邱 文 ，王迎伟 *
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南京医科大学基础医学院免疫学系，江苏 南京 211166

［摘 要］ 目的：研究人胚肾 293T（HEK 293T，简称 293T）细胞中外源性肿瘤坏死因子受体相关因子（tumor necrosis factor
receptor⁃associated factor 6，TRAF6）与 Krüppel 样因子 5（Krüppel⁃like factor 5，KLF5）的结合及 TRAF6 多聚泛素化修饰 KLF5 的
方式和修饰的位点。方法：将构建的Flag⁃TRAF6、HA⁃KLF5、泛素过表达质粒、shTRAF6小干扰质粒和TRAF6 C70A位点突变
质粒行不同组合转染293T细胞48 h。用免疫沉淀（immunoprecipitation，IP）和免疫印迹（immunoblotting，IB）实验检查TRAF6与
KLF5 的结合以及 KLF5 K63 或 K48 多聚泛素化水平。此外，构建 KLF5 全部赖氨酸突变的质粒，分别与 TRAF6 质粒共转染
293T 细胞。用前述 IP/IB 检测 KLF5 K63 连接的多聚泛素化修饰，并确定 KLF5 K63 泛素化修饰的位点。结果：293T 细胞中
TRAF6 能与 KLF5 结合；TRAF6 过表达和基因沉默或 TRA6 酶活性缺失能相应上调或下调 KLF5 K63 的多聚泛素化；KLF5 被
TRAF6 K63 多聚泛素化修饰的位点是其第 99 位和第 100 位的赖氨酸。结论：TRAF6 能与 KLF5 相互作用，并对 KLF5⁃K99 和
K100进行K63多聚泛素化修饰。
［关键词］ 肿瘤坏死因子受体相关因子6；Krüppel样因子5；K63连接的多聚泛素化修饰；HEK 293T细胞
［中图分类号］ R393 ［文献标志码］ A ［文章编号］ 1007⁃4368（2023）04⁃445⁃07
doi：10.7655/NYDXBNS20230401

The pattern and site identification of KLF5 polyubiquitination by TRAF6 in HEK 293T cells

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LI Yu，YING Shuai，GE Wen，RUAN Yuting，WU Ningxia，WANG Weimin，ZHANG Jing，QIU Wen ，WANG
Yingwei *
Department of Immunology，School of Basic Medicine，Nanjing Medical University，Nanjing 211166，China

［Abstract］ Objective：To study the binding of exogenous tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6（TRAF6）to Krüppel⁃like
factors 5（KLF5）as well as the pattern and site of KLF5 polyubiquitination by TRAF6 in HEK 293T（i.e. 293 T）cells. Methods：The
293T cells were co⁃transfected with Flag⁃TRAF6，HA⁃KLF5 and ubiquitin（Ub）expression plasmids，or shTRAF6 and TRAF6 C70A
plasmids in different combinations for 48 h. Then，the binding of TRAF6 to KLF5 and KLF5 K48/K63⁃linked polyubiquitination by
TRAF6 were detected using immunoprecipitation（IP）and immunoblotting（IB）assays. Moreover，the plasmids with all lysine mutation
of KLF5 were constructed，and co⁃transfected with TRAF6 overexpression plasmids into 293T cells. Thereafter，the level of KLF5 K63⁃
linked polyubiquitination and the lysine（site）of KLF5 K63⁃linked polyubiquitination were measured or identified by IP and IB.
Results：TRAF6 and KLF5 in 293T cells could bind with each other. The overexpression of TRAF6 up ⁃ regulated while the
knockdown or activity deficiency of TRAF6 down⁃regulated the level of KLF5 K63⁃linked polyubiquitination. The site of KLF5 K63⁃
linked polyubiquitination was its K99 or K100 lysine. Conclusion：TRAF6 can interact with KLF5 and modify the K99 and K100 of
KLF5 via K63⁃linked polyubiquitination.
［Key words］ tumor necrosis factor receptor⁃associated factor 6；Krüppel⁃like factors 5；K63⁃linked polyubiquitination；HEK 293T
cell
［J Nanjing Med Univ，2023，43（04）：445⁃451］

［基金项目］ 国家自然科学基金（81971468，82171740）
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通信作者（Corresponding author），E⁃mail：qiuwen@njmu.edu.cn；wangyw1508@njmu.edu.cn