Page 12 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第4期
               ·450 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年4月


                       A                                              B
                                     WT  K99R  K100R K99R/100R
                                                                                          **
                                                                              1.5
                                                                                        **
                                                                           K63位泛素化  相对表达水平  0.5
                                                 IP：HA/IB：Ub k63              1.0    *


                              50 kDa             IP：HA/IB：HA                   0
                              48 kDa             IP：HA/IB：Flag                     WT  K99R  K100R
                              50 kDa             IB：HA                                        K99R/100R
                                                        WCL
                              48 kDa             IB：Flag
                 将 TRAF6 过表达与 Ub 质粒及 KLF5（WT）或 K99（K99R）或 K100（K100R）突变质粒或两者联合（K99/100R）突变质粒分别共转染 293T 细
              胞，然后进行IP/IB检测。A：IB条带；B：半定量分析，两组比较，P < 0.05，P < 0.01（n=3）。
                                                         *
                                                               **
                             图6 KLF5 K99，K100和K99/K100联合突变对KLF5 K63连接的多聚泛素化的影响
                Figure 6 The effect of KLF5 K99，K100 mutant and K99/K100 united mutant on KLF5 K63⁃linked polyubiquitination

              KLF5 是一种转录因子，能通过其锌指结构上的                           导致 KLF5 K63 连接的多聚泛素化明显下降，且以

              DNA 结合域与靶基因启动子上的 GC 框和 CACCC                      K99R/K100R联合突变转染的细胞更为显著。这一
              元件结合，调控基因的转录               ［12，16］ 。有资料显示，        结果表明，TRAF6 K63 多聚泛素化修饰 KLF5 的位
              KLF5 能被 E3 连接酶进行泛素化修饰，进而诱导出                       点为K99和K100。
              不同的生物学效应 。                                             值得一提的是：293T 细胞是一种被广泛用于
                              ［16］
                  本课题组多年来一直从事实验性 MsPGN——                        PTM研究的工具细胞，其优点不仅在于其外源性质
              大鼠 Thy⁃1N 基因表达调控的研究           ［3，5，7，9-10］ 。先前研   粒转染细胞效率高，而且在血清剥夺的情况下还能
              究证实，无论是在 Thy⁃1N 大鼠的肾组织，还是用                        快速生长，并易于培养和进行体外实验以验证分子
              sublytic C5b⁃9 刺激的 GMC 中，TRAF6 和 KLF5 的表          之间的相互作用等         ［17］ 。鉴于本课题之前体内外研
              达均见升高     ［8，10］ 。鉴于TRAF6能多聚泛素化修饰转                究 Thy⁃1N 时已经发现 TRAF6 和 KLF5 的表达均明
              录因子已被证实        ［10］ ，因此，为了明确TRAF6和KLF5            显上调，加之有文献已报道了 TRAF6 与 KLF5 的作
              的关系，利用具有高转染性和易于培养的293T工具                          用及作用机制        ［9- 10，12，16］ ，因此为了深入探讨大鼠
              细胞  ［17］ ，检查了 TRAF6 与 KLF5 的结合及 TRAF6 多           Thy⁃1N 发病过程中，升高的 TRAF6 与 KLF5 之间的
              聚泛素化修饰 KLF5 的方式。结果发现，细胞转染                         关系和相关泛素化修饰的作用及其机制，先利用工
              TRAF6 和 KLF5 表达质粒后，其表达的两种蛋白可                      具细胞 293T 观察了外源性 TRAF6 与 KLF5 之间的
              相互结合，且 TRAF6 的表达与否还能相应增加或                         相互作用和TRAF6多聚泛素化修饰KLF5的方式及
              减少 KLF5 K63 连接的多聚泛素化，但对其 K48 相                    其位点，并取得了上述研究结果。不过，由于我们
              连的多聚泛素化修饰并无影响。此外，细胞共转                             要研究的是大鼠 Thy⁃1N，且体外培养的细胞是大
              染 TRAF6 活性位点突变（TRAF6 C70A）和 KLF5 质                鼠的 GMC，故在 293T 细胞中得到的这一结果仅仅
              粒后，也未测到KLF5 K63的多聚泛素化修饰。                          是给了一种提示。考虑到组织细胞本身比较复
                  已知TRAF6泛素化修饰蛋白质上的氨基酸（位                        杂，影响因素颇多，后续是否会出现与前述 293T
              点）是其赖氨酸残基         ［11，13-14］ ，而 KLF5 蛋白含有 19 个    细胞一致的研究结果还有待于今后在大鼠 GMC 和
              赖氨酸   ［12，16，18］ 。为了确定 KLF5 被 TRAF6 K63 多聚        Thy⁃1N大鼠的肾组织中进一步的验证。
              泛素化修饰的位点，本研究将 KLF5 的全部赖氨酸                         ［参考文献］
              进行单个突变或几处相近赖氨酸联合突变以构建
                                                                ［1］ FLOEGE J，DAHA M R. IgA nephropathy：new insights
              相应的突变质粒，在酶切电泳和测序鉴定成功后，                                 into the role of complement［J］. Kidney Int，2018，94（1）：
              分别与 TRAF6 及 Ub 质粒共转染 293T 细胞并检测
                                                                     16-18
              KLF5 K63 连接的多聚泛素化水平。结果显示，                         ［2］ TORTAJADA A，GUTIERREZ E，PICKERING M C，et
              KLF5 K99R或K100R以及K99R/K100R联合突变均                       al. The role of complement in IgA nephropathy［J］. Mol
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