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第43卷第4期          高玉杰，龙启福，李积东，等. 基于转录组学研究高原低氧胁迫对小鼠肾脏能量代谢相关通
                  2023年4月              路的影响机制［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：475⁃483                   ·477 ·


                的西安交通大学医学部实验动物中心，作为本研究                            生物学重复样本之间的基因表达水平采用皮尔逊
                的对照组即平原肾脏对照组（plain kidney control                 相关性检验进行分析。
                group，PKC）；另一组饲养于海拔 4 200 m 的青海省                  1.2.5  差异表达基因分析
                果洛藏族自治州玛多县人民医院实验动物房，作为                                HKT组与PKC组之间DEG的分析通过DESeq2
                实验组即高原肾脏实验组（high⁃altitude kidney test             软件（1.20.0）来完成，每组5个生物学重复。将DEG
                group，HKT）。将两组小鼠置于相同的饲养环境下                        基于|log2FC| > 0，P < 0.05 作为显著差异表达的阈
                分笼喂养，环境温度为 18~25 ℃，相对湿度为 40%~                     值。其中 log2FC > 0 的基因被定义为上调基因，
                50%，在饲养过程中给予相同的水和食物。饲养                            log2FC < 0的基因被定义为下调基因。
                30 d后，在无菌条件下分别采集PKC组和HKT组的                        1.2.6  GO注释和KEGG富集分析
                小鼠肾脏组织，并将组织置于液氮中快速冷冻，然                                通过 clusterProfiler（3.4.4）软件实现 DEG 的 GO
                后于-80 ℃低温储存。                                      分析，考虑校正 P 值 < 0.05 的 GO term 通过 DEG
                1.1.2  实验试剂                                       显著富集。GO 数据库包括生物过程（biological

                    无酶无菌水（北京 Solarbio 公司）；TRIzol RNA              process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和细
                提取试剂（Invitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒                     胞组分（cellular components，CC）3部分。

                PrimeScript TM  RT reagent kit with gDNA eraser、qPCR  KEGG数据库用于从分子水平即基因组测序结
                                              TM
                                ®
                试 剂 盒 TB Green Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH         果来了解生物系统的高级功能和效用，通路数据库
                Plus）（TaKaRa 公 司 ，日 本）；引 物 由 上 海 Sangon           用于在数据库中注释路径上的 DEG 以进行统计分
                Biotech公司合成。                                      析。同样使用 clusterProfiler（3.4.4）软件分析 KEGG
                1.2  方法                                           通路中 DEG 的显著富集分析并计算 P 值，P < 0.05
                1.2.1  总RNA的提取                                    为显著富集。
                    根据制造商的说明使用 TRIzol 试剂，从 PKC 组                  1.2.7  RT⁃qPCR验证
                和HKT组的肾脏组织样本中提取总RNA，然后立即                              为了验证本次转录组测序结果的准确性，随机
                储存在-80 ℃的冰箱中。通过纳米光度计光谱仪检                          挑选了 15 个表达上调或下调的基因进行 RT⁃qPCR
                测 RNA 纯度，同时用安捷伦 2100 生物分析仪检测                      验证，其引物信息详见表 1。cDNA 使用逆转录试
                RNA的完整性及其质量。                                      剂盒合成，根据制造商的说明使用反转录 cDNA，
                1.2.2  cDNA文库的构建与质检                               以β⁃actin 作为内部参考基因，采用 LightCycler 96
                                                                                                            ®
                    建库起始 RNA 为 total RNA，总量≥1 μg。建库               SW 1.1 检测系统进行实时荧光定量 PCR，测定基因
                中使用的建库试剂盒为 Illumina 试剂，在逆转录酶                      mRNA 表达量。PKC 组基因表达相对于 HKT 组的
                体系中合成 cDNA 第 1 条链，随后用 RNase H 降解                  倍数变化用2      -ΔΔCT 方法计算。
                RNA 链，然后以 dNTPs 为原料合成 cDNA 第 2 条链，                1.3  统计学方法
                然后对 cDNA 进行纯化和扩增，最终获得文库。然                             SPSS18.0 软件用于所有统计分析，符合正态分
                后使用 RT⁃qPCR 技术对文库有效浓度进行准确定                        布的计量资料采用均数±标准差（x ± s）表示。使用
                量（文库有效浓度高于2 nmol/L），以保证文库质量。                      两独立样本t检验比较HKT组与PKC组的DEG，同时
                1.2.3  Illumina测序                                 用 GraphPad Prism 8.0 软件对 DEG 的 mRNA 表达量
                    库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标                          进行绘图，P < 0.05为差异有统计学意义。
                下机数据量的需求 pooling 后进行 Illumina 测序（北
                                                                  2 结    果
                京诺禾致源有限公司）。
                1.2.4  RNA⁃Seq质量评估和序列对比                           2.1  测序数据处理与质量评估
                    为了保证数据分析的质量及可靠性，需要对高                              通过双端测序法分别对PKC和HKT的5个重复
                通量测序仪测得的原始数据（reads）进行过滤，同时                        样本进行测序，构建转录组文库，并对原始数据进行
                对clean data进行Q20、Q30和GC含量计算。直接从                   质量控制，获得了41.47 M（PKC）和40.68 M（HKT）的
                基因组网站下载参考基因组和基因模型注释文                              clean reads。测序所得数据碱基错误率均为0.02%，
                件。使用HISAT2 v2.0.5构建参考基因组的索引，并                     且各个样本 Q20 均 > 98.14%、Q30 均 > 94.47%，GC
                将配对末端 clean reads 与参照基因组比对，对 5 个                  含量在 46.97%~48.71%。因此，本次转录组测序数
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