Page 68 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
               ·650 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


              孵育1 h，PBS洗涤3遍后，DAPI室温孵育10 min，封                                 表1 实时定量PCR引物
              片，荧光显微镜拍片，在观察视野中选取 8~10 个细                                   Table 1 Primers for qRT⁃RCR
              胞，Image J分析F⁃actin荧光强度以及ADF/CFL⁃1的                  引物名称                     序列（5′→3′）
              表达定位。                                               M⁃q⁃Gapdh⁃F      GCCTCCTCCAATTCAACCCT
                                                                  M⁃q⁃Gapdh⁃R      ACTGTGCCGTTGAATTTGCC
              1.2.5 细胞划痕实验
                                                                  M⁃q⁃RhoA⁃F       TGAAGACAGTGAGGGTTTGGG
                  用直尺在6孔板底部画间隔1 cm的直线。将消
                                                                  M⁃q⁃RhoA⁃R       CATCCACCTCGATATCCGCC
              化下来的细胞重悬移入6孔板，每孔约5×10 个细胞，
                                                    5
                                                                  M⁃q⁃ROCK2⁃F      AAACTGTGATCCCAAGGGAAGG
              待细胞生长融合成单层状态后，用灭菌的200 μL枪                           M⁃q⁃ROCK2⁃R      CAACGTCAATCGGAGGCGGA
              头垂直于6孔板底部横线划线，PBS洗涤3遍使得划                            M⁃q⁃LIMK1⁃F      GATGGGGAAGCTTAGGCCAG
              痕边缘清晰，随后加入无血清培养基。分别在0、12、                           M⁃q⁃LIMK1⁃R      CACCAGTGTGTAGGTGTCCC
              24 h用倒置荧光显微镜拍照保存，使用Image J软件
              进行分析。                                             异性标记。在 Osbpl2⁃WT HEI⁃OC1 细胞中，细胞周
              1.2.6 Western blot实验                              围微刺突和丝状伪足丰富；分布于细胞周边的F⁃ac⁃
                  取处在对数生长期的细胞株培养瓶，弃去培养                          tin 外周致密束线条连续清晰，界限分明；由非极性

              液后，PBS 清洗 3 遍。加入含蛋白酶抑制剂的 RIPA                     单行排列的肌动蛋白丝组成的应力纤维以及核区
              强裂解液于冰上裂解 15 min；将细胞裂解液转移至                        周围的核骨架线条清晰，分布均匀，轮廓完整，在细
              1.5 mL 离心管，冰浴中超声破碎处理 3 次，每次 5 s；                  胞中平行排列或者纵横交错形成网状结构。而在
              12 000 r/min离心10 min（4 ℃），收集上清，采用BCA              Osbpl2⁃KO HEI⁃OC1 细胞中，细胞外周微刺突和丝
              法测定各样品蛋白浓度。取等量蛋白，采用 12%                           状伪足明显减少；F⁃actin 外周较为致密，但轮廓并
              SDS⁃PAGE 电泳分离蛋白，并转移至 PVDF 膜上。                     不连续完整；核骨架以及应力纤维分布明显减少
              5%脱脂奶粉溶液封闭2 h，PBS洗涤后加入一抗4 ℃                       （图1A）。对细胞F⁃actin骨架的免疫荧光检测表明，
              孵育过夜，加入相对应二抗室温孵育 2 h，PBS 洗涤                       Osbpl2⁃KO HEI⁃OC1细胞的F⁃actin骨架荧光强度明
              后采用增强化学发光显色法显色，采用凝胶成像系                            显变弱。细胞划痕实验结果表明，Osbpl2⁃KO HEI⁃
              统观察拍照。                                            OC1 细胞迁移能力相比 Osbpl2⁃WT 细胞明显减弱
              1.2.7 实时定量PCR                                     （图 1B）。以上结果表明，Osbpl2⁃KO 显著影响了
                  使用 TRIzol 提取 HEI⁃OC1 细胞总 RNA，测定               HEI⁃OC1 细胞的 F⁃actin 细胞骨架形态、分布和完
              RNA 浓度后，取 1 μg 总 RNA 反转录成 cDNA，然后                 整性。
              进行实时荧光定量 PCR（real⁃time quantitative PCR，          2.2  Osbpl2 ⁃ KO 抑 制 了 HEI ⁃ OC1 细 胞 中 RhoA/
              qRT ⁃ PCR）检 测 。 采 用 20 μL 扩 增 体 系 ：               ROCK2信号通路
              SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游              基于OSBPL2对HEI⁃OC1细胞F⁃actin细胞骨架
                   ®
              引物各0.5 μL，ddH2O 8 μL。扩增程序如下：预变性                   结构和功能的影响，OSBPL2 可能通过介导 RhoA/
              95 ℃ 5 min；变性 95 ℃10 s，退火/延伸 60 ℃ 30 s，共          ROCK2 信号通路在听觉细胞肌动蛋白细胞骨架的
              40 个循环，目标基因 CT值使用 GAPDH 基因 CT值校                   结构和功能维持中发挥重要作用。qRT⁃PCR 和
              正。引物序列见表1。                                        Western blot 检测结果表明，在 Osbpl2⁃KO HEI⁃OC1

              1.3  统计学方法                                        细胞中，RhoA、ROCK2和LIMK1的转录和蛋白表达
                  每组实验至少重复 3 次，使用 GraphPad Prism                水平均呈现不同程度的下调（图 2），而 LIMK1 作为
              软件进行相关统计学分析。实验数据采用均数±标                            Rho/ROCK 信号通路重要的下游分子，其磷酸化修
              准差（x ± s）表示，两独立样本采用t检验进行组间比                       饰程度影响肌动蛋白细胞骨架的解聚和聚合。以
              较，P < 0.05为差异有统计学意义。                              上结果表明，OSBPL2 通过介导 HEI⁃OC1 细胞中
                                                                RhoA/ROCK2 信号通路来调控肌动蛋白细胞骨架，
              2  结 果
                                                                Osbpl2⁃KO 抑制了 HEI⁃OC1 细胞中 RhoA/ROCK2 信
              2.1  Osbpl2⁃KO对HEI⁃OC1细胞肌动蛋白骨架形态                  号通路的活性，导致下游 LIMK1 磷酸化水平降低，
              和功能的影响                                            使得肌动蛋白细胞骨架的稳定性减弱，从而导致肌
                  采用 Phalloidin 对细胞 F⁃actin 细胞骨架进行特             动蛋白细胞骨架的功能缺陷。
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