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第43卷第5期 张 城，杨         倩，姚 俊，等. OSBPL2介导RhoA/ROCK2信号通路调控听觉细胞肌动蛋白细胞骨架［J］.
                  2023年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：648-654                        ·649 ·


                    氧化固醇结合蛋白样蛋白 2（oxysterol binding               克）、肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白 1（actin depoly⁃
                protein⁃like 2，OSBPL2）与氧化固醇结合蛋白（oxys⁃             meriza factor/cofilin 1，ADF/CFL⁃1）抗体（5175，CST
                terol binding protein，OSBP）同源，属于 OSBP 相关蛋         公司，美国）、Lim激酶1（LIM domain kinase 1，LIMK1）
                白（OSBP⁃related protein，ORP）家族成员，作为一种              抗体（A16664，武汉爱博泰克），Phospho⁃LIMK1抗体
                重要的固醇感受器，参与了脂质代谢、囊泡运输、信                          （APO387，武汉爱博泰克），山羊抗鼠、抗兔IgG二抗
                号转导和细胞骨架调控等生物学过程 。本课题组                           （SA00001⁃1、SA00001⁃2，武汉 Proteintech 公司）、荧
                                                 ［1］
                在前期研究中发现OSBPL2是常染色体显性遗传性                          光标记山羊抗鼠、抗兔二抗（1741782、1748346，上
                                                    ［2］
                非综合征型耳聋（DFNA）的致病基因之一 ，OSBPL2                      海赛默飞）。
                敲除的巴马小型猪以及小鼠模型均表现为进行性                                 其他试剂：Western 及 IP 细胞裂解液（P0013，南
                听力损失，并伴随有毛细胞静纤毛的形态异常                      ［3-4］ 。  京碧云天）、RIPA 裂解液（P0013B，南京碧云天）、
                毛细胞静纤毛是主要由肌动蛋白构成的特化细胞                             SYBRRGreen Master Mix（Q131，南京诺唯赞）、TGX
                器，静纤毛以及肌动蛋白骨架功能正常是听觉发生                            Stain⁃Free FastCast Acrylamide Kit、基因扩增引物
                                                                           TM
                                                                                    TM
                的必要条件。OSBPL2在耳蜗内毛细胞和外毛细胞                          由北京擎科生物科技有限公司合成。
                的静纤毛中均有定位 ，提示OSBPL2在听觉细胞的                         1.2  方法
                                  ［5］
                肌动蛋白骨架调控中可能发挥重要作用。有研究                             1.2.1 细胞培养
                发现，OSBPL2缺失会导致HuH7细胞中黏着斑激酶                            在 DMEM 培养基中加入 10%胎牛血清制成完
               （focal adhesion kinase，FAK）的磷酸化水平降低，并              全培养基。将 HEI⁃OC1 细胞培养在 DMEM 完全培
                进一步抑制细胞肌动蛋白骨架重塑、伪足与细胞极                            养基中，置于10% CO2饱和湿度的33 ℃细胞培养箱
                性形成、细胞迁移、细胞黏附和细胞周期 。此外，                           中培养，当细胞密度达到80%~90%，用胰酶消化、传
                                                    ［6］
                OSBPL2也可以作为肌动蛋白细胞骨架的脂质感受                          代并冻存，以备后续实验使用。
                器，通过介导RhoA信号通路影响肝脏细胞的迁移、                          1.2.2 耳蜗组织采集
                          ［7］
                黏附和增殖 。RhoA 是 Rho GTPase 家族重要成员                       取 Osbpl2⁃KO 小鼠和 Osbpl2⁃WT 对照小鼠，麻
                之一，参与了多种以肌动蛋白为基础的生物学过                             醉后用生理盐水进行心脏灌注。待灌注出的生理
                程，特别在肌动蛋白细胞骨架的重排中发挥重要调                            盐水澄清后，给小鼠断头，取出耳蜗，体视显微镜下
                控作用 。但在内耳组织和听觉细胞中，OSBPL2是                         用镊子去除多余肌肉组织并在蜗顶打洞后多聚甲
                      ［8］
                否存在同样的调控机制仍需进一步研究。本研究                             醛固定过夜，第 2 天将耳蜗取出用 PBS 清洗 3 遍后，
                将从体内外水平研究OSBPL2参与听觉细胞肌动蛋                          置于EDTA慢脱钙液中，脱钙7~10 d，脱钙过程中可
                白细胞骨架调控的机制，为进一步探索 OSBPL2 生                        用镊子夹一下耳蜗来衡量脱钙状态，镊子夹起富有
                物学功能及其突变致聋机制提供理论依据。                               弹性则表示脱钙完成。
                                                                  1.2.3 扫描电镜
                1  材料和方法
                                                                      将完成脱钙的小鼠耳蜗置于体式显微镜下，采
                1.1  材料                                           用显微镊与显微剪分离基底膜，浸入 5%戊二醛固
                    小鼠耳蜗感觉上皮永生化细胞株 HEI⁃OC1 细                      定过夜；将固定后的基底膜依次浸入 50%、70%、
                胞及其 OSBPL2 敲除（Osbpl2⁃KO）细胞株由本实验                   90%、100%乙醇中脱水各 5 min，冻干后喷金；扫描
                室构建和保存 ，Osbpl2⁃KO 小鼠及其同窝野生型                       电镜下观察毛细胞静纤毛的形态与排列，并在不同
                             ［9］
               （Osbpl2⁃WT）小鼠由南京医科大学动物中心净化并                        观察视野中选取 17~18 个细胞，Image J 统计静纤毛
                配繁 。实验经过南京医科大学动物福利伦理委员                            长度和宽度。
                    ［4］
                会同意（伦理编号：IACUC⁃1801003⁃1）。                        1.2.4 细胞爬片免疫荧光染色

                    实验所用抗体：纤维肌动蛋白（fibros actin，F⁃                     待细胞密度为 60%~80%时，吸弃原培养基，在
                actin）抗体（MA1⁃80729，上海赛默飞）、OSBPL2抗体                培养板中将已爬好细胞的玻片用4 ℃预冷PBS洗涤

               （14751 ⁃ 1 ⁃ AP，武 汉 Proteintech 公 司）、GAPDH         3 遍；4%多聚甲醛固定爬片 30 min，PBS 浸洗玻片 3
               （5174S，CST，美 国）、RhoA（A19106，武 汉 爱 博 泰              次，每次 3 min；0.3% Triton X 室温穿膜 30 min，山羊

                克）、Rho 激酶 2（Rho⁃associated coiled⁃coil⁃contain⁃   血清封闭 30 min；加稀释后的一抗 4 ℃孵育过夜，
                ing proteing kinase2，ROCK2）（A5698，武汉爱博泰           PBS洗涤3遍，每遍5 min，加稀释后的二抗室温避光
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