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第43卷第5期 成秀梅，杨 雅，魏楚蓉，等. 白藜芦醇通过Ca /Caspase⁃3途径减轻内质网应激诱导的神经细胞凋亡［J］.
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2023年5月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：678-683 ·679 ·
可使胞浆钙失衡，引起钙超载，是细胞凋亡的重要 每次15 min，并在室温下与HRP标记的二抗（1∶3 000）
［2］
病理生理因素 。钙超载可损伤线粒体功能，释放 孵育 1 h，用 TBST 洗涤 2 次，ECL 显色，使用 Bio⁃Rad
细胞色素 C，从而激活 Caspase⁃3、磷脂酶、蛋白酶和 成像系统检测蛋白条带。
［3］
内切酶，引起细胞凋亡 。 1.2.3 胞浆Ca 浓度测定
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白藜芦醇（resveratrol，RES）是一种存在于葡萄 采用Fluo⁃3/AM和共聚焦系统测定细胞内游离
皮和葡萄酒中的非黄酮类多酚有机化合物，具有抑 Ca （intracellular free Ca ，［Ca ］ i ）浓度。处理后，将
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制血管平滑肌细胞增殖与迁移 、抗炎抗凋亡 等 PC12细胞与3 μmol/L Fluo⁃3/AM孵育50 min，然后用
［5］
［4］
作用。众多研究报道，RES可通过抗氧化、抗炎对蛛 EBSS 洗涤 3 次，随机选择 3 个视野采用激光共聚焦
网膜下腔出血发挥神经保护作用 ；通过调节线粒 显微镜拍摄，运用 LAS AF 2.5.1.6757 软件分析荧光
［6］
体动态平衡减轻脑缺血再灌注损伤 ；能够以浓度 强度，荧光的强弱表示［Ca ］ i的高低。
［7］
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依赖性方式逆转H2O2诱导的Caspase⁃3表达增加、活 1.2.4 Caspase⁃3活性的测定
性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生以及线粒 PC12 细胞处理后，采用比色法测定 Caspase⁃3
体膜电位（mitochondrial membrane potential，MMP） 的活性 ［11］ 。将 30 μL 细胞裂解液加入含 60 μL 缓冲
的降低，从而保护视网膜神经节细胞免受H2O2诱导 液的 96 孔板中，再将 10 μL Caspase⁃3 催化底物
的凋亡 ；可通过抑制1⁃甲基⁃4⁃苯基吡啶诱导的小 Ac⁃DEVD⁃pNA（终浓度为 200 μmol/L）。反应混合
［8］
鼠海马神经元内ROS升高和钙超载，降低Caspase⁃3 物37 ℃孵育90 min，并在405 nm处读取吸光度值表
表达和凋亡，表明RES可抑制氧化应激发挥神经保 示Caspase⁃3的活性。
护作用 。另外，RES 可抑制乙醇诱导的内质网特 1.2.5 凋亡率的检测
［9］
［10］ ［12］
征蛋白 GRP78 的过表达，表明 RES 可抑制 ERS 。 采用流式细胞术检测 PC12 细胞凋亡率 。处
然而，RES 能否通过抑制 ERS 诱导的钙超载，阻止 理结束后，细胞（1×10）用 pH7.4 的 PBS 洗涤 2 次，
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Caspase⁃3 的激活，从而减轻神经细胞凋亡，目前仍 2 000 r/min离心5 min。然后将细胞重悬于pH7.4的
未阐明。 结合缓冲液中，该缓冲液含有 140 mmol/L NaCl、
10 mmol/L HEPES和2.5 mmol/L CaCl2，另含50 μg/mL
1 材料和方法
碘化丙啶，常温避光孵育30 min，上机检测。
1.1 材料 1.3 统计学方法
TG、BAPTA/AM（Sigma 公司，美国）；Fluo⁃3/AM 数 据 采 用 均 值 ± 标 准 差（x ± s）表 示 ，使 用
和胰蛋白酶（Invitrogen 公司，美国）；DMEM 和 FBS SPSS11.0软件进行统计分析。组间差异的显著性通
购自 GIBCO 公司；β⁃actin、GRP78 和一抗（Abcam 公 过单因素方差分析确定，组间比较采用 LSD⁃t 检
司，美国）；离子霉素（ionomycin），CCK⁃8和碘化丙啶 验。在所有实验中，P < 0.05为差异有统计学意义。
（南京碧云天）；PC12细胞来自中国科学院培养物保
2 结 果
藏中心。
1.2 方法 2.1 RES抑制TG诱导的ERS
1.2.1 细胞培养和处理 为了评估RES对ERS的影响，采用12.5 μmol/L、
PC12细胞采用含有10％FBS，100 U/mL青霉素 25.0 μmol/L RES 预处理 PC12 细胞 24 h 后，再用
和 100 μg/mL 链霉素的 DMEM 培养基于 37 ℃95％ 400 nmol/L TG 处 理 24 h。 采 用 免 疫 印 迹 检 测
空气和5％CO2混合气体中进行传代培养，构建ERS GRP78 蛋白的表达以反映 ERS 情况（图 1）。TG 处
细胞模型 ，即 RES 预处理 PC12 细胞 24 h 后，用 理使 PC12 细胞 GRP78 蛋白表达升高到对照组的
［1］
ERS诱导剂（TG，400 nmol/L）处理PC12细胞24 h。 （2.36 ± 0.14）倍（P < 0.01），25.0 μmol/L RES 预处理
1.2.2 免疫印迹 组 GRP78 表 达 为 对 照 组 的（1.49 ± 0.58）倍（P <
采用蛋白质定量试剂盒（BCA 法）测定蛋白质 0.05），明显低于TG处理组（P < 0.05）。上述结果表
浓度，通过10％ SDS⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白 明，TG可诱导ERS，25.0 μmol/L RES抑制TG诱导的
质，并将其转移到PVDF膜上。用5％脱脂奶粉溶液 ERS。
封闭后，将膜分别与一抗［GRP78（1∶500），β⁃actin 2.2 RES阻止ERS诱导PC12细胞钙超载
（1∶1 000）］于4 ℃杂交过夜，然后用TBST洗涤2 次， 为了探讨 RES 对 ERS 诱导［Ca ］ i变化的影响，
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