Page 92 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第5期
·674 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年5月

A B
0 μg/mL 10 μg/mL *
100
10 μg/mL 20 μg/mL *
100
20 μg/mL 50 μg/mL
80 50 μg/mL 80 100 μg/mL
* 100 μg/mL （ % ）
（ % ） 60 60
H2O2 * SOD活性 40
40
20
*
20 0
30 min 60 min 90 min 120 min
*
0
30 min 60 min 90 min 120 min
A：不同浓度PB的模拟CAT活性，与 0 μg/mL比较，P < 0.001（n=3）；B：不同浓度PB的模拟SOD活性，两组比较，P < 0.001（n=3）。
*
*
图3 普鲁士蓝纳米酶对细胞外ROS的清除效率
Figure 3 Extracellular ROS scavenging activity of PB
（图4A）。 6B），表明 PB 对 MC3T3⁃E1 细胞的抗氧化作用可以
通过酶标仪定量检测了细胞内ROS水平，不同 持续至成骨分化晚期。
浓度的 H2O2 （0、10、25、50、100、200 μmol/L）刺激 2.4.3 PB 对 MC3T3⁃E1 细胞成骨相关基因表达的
MC3T3⁃E1 细胞后，DCF 荧光强度随着 H2O2浓度的 影响
上升而增高，而 PB 的存在可以明显降低细胞内的 为了进一步验证氧化微环境下PB对MC3T3⁃E1
DCF荧光强度即ROS水平，表明PB对细胞内的ROS 细胞成骨的影响，将 3 组 MC3T3⁃E1 细胞成骨诱导
也有较好的清除活性（图4B）。 7 d 后，运用实时荧光定量 PCR 分别分析成骨分化
此外，通过鬼笔环肽染色，倒置显微镜下进一 基因 Runx⁃2（图 7A）、ALP（图 7B）、Col⁃Ⅰ（图 7C）、
步观察了20 μg/mL PB对细胞骨架和结构的影响，荧 OCN（图 7D）的表达。结果显示，除了 OCN 基因，其
光图显示20 μg/mL PB的加入对MC3T3⁃E1细胞的骨 余成骨分化相关基因中，H2O2组的表达水平明显降
架和形态无明显改变（图4C）。故采取20 μg/mL浓度 低，而PB组的表达水平均高于对照组，差异有统计学
的PB进行抗氧化成骨部分的实验。 意义。OCN基因的表达水平在3组中并未出现显著
2.4 氧化微环境下 PB 对 MC3T3⁃E1 细胞成骨分化 性变化，可能是该基因在成骨早期表达还不明显。
的影响
3 讨 论
2.4.1 PB对MC3T3⁃E1细胞ALP活性的影响
为了研究 PB 在氧化微环境下对 MC3T3⁃E1 细 本研究使用 PVP 包裹的 PB 进行实验，首先对
胞 早 期 成 骨 分 化 的 影 响 ，对 成 骨 诱 导 7 d 后 的 PB进行表征，结果显示PB为直径约100 nm、表面带
MC3T3⁃E1细胞分别做了ALP染色（图5A）和ALP活 负电荷、呈典型立方体形状的纳米颗粒。PVP 作为
聚合物保护剂可以降低表面能，抑制团聚，并增加
性定量检测（图5B）。结果显示，在200 μmol/L H2O2
的阳性刺激下，MC3T3⁃E1细胞的成骨分化能力显著 纳米颗粒的溶解度。扫描电镜图中可以看到，PB粒
降低，而PB的存在可以增强细胞抗氧化能力，调节氧 径均一，分散性好，未发生团聚。PB 的面心立方单
化微环境，使细胞的成骨分化能力维持正常水平。 元由三价铁离子、亚铁离子和氰化物离子组成，铁离
2.4.2 PB对MC3T3⁃E1细胞外基质矿化活性的影响 子与氰化物的氮原子相连，而亚铁离子则由氰化物的
为了研究 PB 在氧化微环境下对 MC3T3⁃E1 细 碳原子相连，交替协调形成一个立方单元 。FTIR
［12］
胞晚期成骨分化的影响，对成骨诱导 21 d 后的 光谱验证了PB中碳氮键的存在。
MC3T3⁃E1细胞进行了茜素红染色和茜素红半定量 生物安全性实验显示，浓度在 150 μg/mL 以下
检测。结果显示，成骨诱导21 d后对照组和PB组均 的PB生物相容性较好，因此后续抗氧化性实验使用
浓度 0~100 μg/mL 的 PB 进行。细胞 TEM 结果显示
有矿化物沉积，茜素红染色较深，而200 μmol/L H2O2
阳性刺激组仅可见少量散在红色钙结节，染色也较 PB 可以进入细胞内，这有利于 PB 直接作用于细胞
浅（图 6A）。半定量检测结果与染色结果相同（图 内的ROS，更好发挥其作用。