Page 90 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
·672 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年5月
心，收集上清液，分别按照BCA总蛋白检测盒和ALP 荧光定量PCR，检测成骨分化基因Runt相关转录因
检测试剂盒的说明书检测总蛋白浓度和ALP活性。 子 2（Runt⁃related transcription factor 2，Runx⁃2）、Ⅰ
1.2.4.2 茜素红染色 型胶原蛋白（collagen type⁃Ⅰ，Col⁃Ⅰ）、ALP、骨钙素
细胞分组和成骨诱导方法同前。成骨诱导21 d （osteocalcin，OCN）的表达。引物由上海生工生物工
后，吸去原培养基，超纯水轻柔洗涤3次，用4%多聚 程有限公司合成（引物序列见表1）。靶基因的相对
甲醛在室温下固定细胞30 min。去除固定液，超纯水 表达量根据方程式2 -ΔΔCt 计算。
轻轻洗涤3次，每孔加入茜素红S染液1 mL，室温下 1.3 统计学方法
染色20~30 min。扫描仪拍照，倒置显微镜下观察。 所有定量数据均采用SPSS 22.0 进行统计分析，
每孔加入 10% 氯化十六烷吡啶（cetyl pyridini⁃ Graphpad Prism 7 进行作图，结果以均数±标准差（x
um chloride，CPC）溶液，待茜素红溶解后，Spectra ± s）表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较
Max 190 酶标仪测560 nm处D值。 采用最小显著性差异法（least⁃significant difference，
1.2.4.3 实时荧光定量PCR LSD）检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
细胞分组和成骨诱导方法同1.2.4.1。成骨诱导
2 结 果
至第 7 天时，弃原培养基，收集细胞，使用 RNA 提
取试剂盒分离总 RNA，将其逆转录为 cDNA。采用 2.1 PB的表征
TaKaRa SYBR Premix Ex TaqⅡ试剂盒配成10 μL反 尺寸和结晶度是纳米材料性能的关键因素。
应体系在QuantStudio7荧光定量PCR仪上进行实时 TEM 图像显示，PB 为立方体形态的纳米颗粒，直径
表1 qPCR的引物序列
Table 1 Primer sequences of qPCR
基因名称 上游序列（5′→3′） 下游序列（5′→3′）
β⁃actin CATCCGTAAAGACCTCTAGCCAAC ATGGAGCCACCGATCCACA
Runx⁃2 TGCAAGCAGTATTTACAACAGAGG GGCTCACGTCGCTCATCTT
Col⁃Ⅰ GACATGTTCAGCTTTGTGGACCTC GGGACCCTTAGGCCATTGTGTA
ALP GCAGTATGAATTGAATCGGAACAAC ATGGCCTGGTCCATCTCCAC
OCN AGCAGCTTGGCCCAGACCTA TAGCGCCGGAGTCTGTTCACTAC
约为100 nm（图1A）；高分辨率透射电镜图像清晰显 2.2 PB的体外生物相容性
示了PB表面晶格条纹（图1B），表明PB具有较好的 将 不 同 浓 度 的 PB 溶 液（0、10、20、50、100、
结晶度；SEM 图像显示 PB 粒径均一，表面呈“颗粒 150 μg/mL）与 MC3T3⁃E1 细胞共培养。CCK⁃8 结果
状”，为表面包覆剂 PVP 的存在（图 1C）；MC3T3⁃E1 显示，浓度大于 20 μg/mL 之后，细胞活性随着 PB
细胞的透射电镜图证实了 PB 可以被胞吞进入细胞 浓度的增加而减小（图 2A）。流式细胞仪检测不同
质（图1D），这有利于PB更好地发挥其功能学作用。 浓度PB（0、10、20、50、100、150 μg/mL）对MC3T3⁃E1
20、50、250 μg/mL 的 PB 紫外⁃可见光吸收光谱 细胞凋亡的影响，也出现相似的趋势，浓度增加到
（UV⁃VIS）均呈现 PB 的典型光谱，即由于 Fe（Ⅱ）和 150 μg/mL 时，正常活性细胞降低到76%，早期凋亡
Fe（Ⅲ）之间存在价态电荷转移，峰值在 700 nm 左 细胞增加到20.7%（图2B）。故后续抗氧化活性实验
右（图1E）；Zeta 电位平均为-21.8 mV，表面带负电 采用0~100 μg/mL浓度的PB。
荷（图 1F）；水动力平均粒径为 130.9 nm（图 1G）； 2.3 PB在细胞内外的ROS清除活性
FTIR 光谱图显示了 PB 的结构组成（图 1H），处于 2.3.1 PB对细胞外ROS的清除活性
⁃1
2 086 cm 的主吸收峰归属于 PB 中 Fe（Ⅱ）-CN-Fe H2O2和超氧阴离子是创伤期间细胞中产生的
（Ⅲ）中 C≡N 键的伸缩振动，1 639 cm 处的吸收峰 最丰富的活性氧类。通过二甲酚橙法测定分析了
⁃1
归属于 PVP 中酰胺基团的 CO 伸缩振动，表明 PB 的总 H2O2降解能力。结果表明，PB 对 H2O2的降
PVP 成功包覆于纳米粒子表面，3 443 cm 处的宽 解具有时间和浓度依赖性（图 3A），并且 20 μg/mL
-1
吸收峰归属于羟基（O-H），表明 PB 结构中存在间 PB在作用120 min时，超过50%的H2O2已经被降解。
隙水。 通过测量黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应系统产生
