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第43卷第5期        陈   露，唐诗佳，钟彩英，等. 氧化微环境中普鲁士蓝纳米酶促进MC3T3⁃E1细胞成骨分化［J］.
                  2023年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：669-677                        ·671 ·


                定PB最大吸收波长；通过纳米粒度及Zeta电位分析                         同浓度 PB 溶液（0、10、20、50、100 μg/mL）和 WST⁃8/
                仪分析PB的表面电荷和水动力尺寸；傅里叶红外光                           酶工作液。混匀后，在 37℃振荡（100 r/min）孵育。
                谱仪获得PB红外吸收光谱（FTIR）。                               每隔一定时间（30、60、90、120 min），从反应混合物
                1.2.2 PB的体外生物相容性                                  中取出溶液180 μL和20 μL稀释后的反应启动工作
                    将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 5×10 个的密度接种                  液混匀，37 ℃孵育 30 min，用 Spectra Max 190 酶标
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                于96孔板中，培养24 h后，加入PB溶液分别使各孔                        仪测定450 nm处的D值（n=3）。
                PB 终浓度为 0、10、20、50、100、150 μg/mL，其中，含             1.2.3.3 PB对细胞内ROS的清除效率
                0 μg/mL PB 的完全培养基培养的细胞组设置为空                           使用DCFH⁃DA 荧光探针标记MC3T3⁃E1细胞，
                白对照组。培养 24 h 和 48 h 后，弃原培养液，每孔                    倒置荧光显微镜下观察细胞内ROS水平。分组：对

                加入100 μL的工作液（CCK⁃8与完全培养基按1∶10                     照组、PB 组、Rosup 阳性对照组、Rosup+PB 组。将
                混合所得），37 ℃、5% CO 2恒温培养箱中孵育2 h，每                   MC3T3⁃E1细胞以1×10 个/孔接种于12孔板内，24 h
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                孔吸出 80 μL 液体至另一块 96 孔板中，Spectra Max               后，更换无血清的培养基继续培养，其中 PB 组和
                190 酶标仪测450 nm波长处的吸光度。                            Rosup+PB 组加入终浓度为 20 μg/mL 的 PB。24 h
                    将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 1×10 个的密度接种                  后，Rosup 组和 Rosup+PB 组加入阳性 Rosup 试剂刺
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                于12孔板中，24 h后换含0~150 μg/mL不同浓度PB                   激细胞 15 min，PBS 洗 3 遍，每组细胞均加入预先用
                的培养基继续培养 24 h，胰酶消化，收集细胞，用荧                        无血清培养基配好的 DCFH⁃DA 探针（20 nmol/L），
                光素（FITC、Alexa Fluor488 等）标记的 Annexin⁃V 和          37 ℃避光孵育30 min，倒置荧光显微镜下观察。
                碘化丙啶（propidine iodide，PI）作为探针，流式细胞                    MC3T3⁃E1细胞以5×10 个/孔接种于24孔板内，
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                仪检测细胞凋亡的发生。                                       24 h 后加入配好的 20 nmol/L 浓度的 DCFH⁃DA 探
                1.2.3 PB的体外抗氧化活性                                  针，37 ℃避光孵育30 min，用PBS洗3遍。随后每孔
                1.2.3.1 PB模拟CAT活性                                 加入不同浓度的H2O2 （0、10、25、50、100、200 μmol/L）
                    使用专门的H2O2检测试剂盒，通过测定反应混                        刺激细胞。各组分别加入终浓度为 20 μg/mL 的
                合物中剩余 H2O2 的浓度来检测 PB 的模拟 CAT 活                    PB，混匀，避光孵育4 h，测荧光强度（EX=504 nm）。
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                性。5个1.5 mL的离心管中，加入800 μL 100 μmol/L                   将 MC3T3⁃E1 细胞以每孔 1×10 个的密度接种
                浓 度 的 H2O2 液 ，再 分 别 加 入 不 同 量 的 PB 溶 液            于 12 孔板中，24 h 后一组用不含 PB 的培养基继续
               （250 μg/mL），使终浓度分别为0、10、20、50、100 μg/mL            培养，另一组用含20 μg/mL PB的培养基继续培养，
               （n=3）。混匀后，在 37 ℃振荡孵育（100 r/min）。每                  24 h后弃原培养基，PBS洗3遍，4%多聚甲醛室温固
                隔一定时间（15、30 、60 、90 、120 min），从反应混合               定30 min，PBS冲洗，0.5% Triton X⁃100 孵育10 min，
                物中取出溶液 50 μL，按试剂盒说明书使用二甲酚                         PBS 漂洗 5 次。加入鬼笔环肽室温条件下染色 20
                橙法测定剩余H2O2浓度。即将50 μL的样品溶液与                        min，PBS 冲洗 5 次后加入 DAPI 室温染 30 s，倒置荧
                100 μL 的 H2O2检测液混合，在室温下孵育 30 min，                 光显微镜观察细胞形态。
                然后用 Spectra Max 190 酶标仪测 560 nm 处的吸光              1.2.4  氧化微环境下 PB 颗粒对 MC3T3⁃E1 细胞的
                度（D）值。根据先前制作的 H2O2浓度标准曲线，将                        促成骨分化作用
                D值转换为H2O2浓度。                                      1.2.4.1 ALP染色及活性检测
                1.2.3.2 PB模拟SOD活性                                     MC3T3⁃E1 细胞以 1×10 个/孔的密度接种于
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                    使用WST⁃8法，根据总SOD活性检测试剂盒使                       12 孔板中，待其融合至 60%~70%，弃原培养基，加
                用说明书，分析 PB 纳米颗粒的超氧化物清除活性。                         入成骨诱导培养基成骨诱导7 d，2~3 d换液，每次换
                该测定中，由黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应系统产生的                           液都重新加入 H2O2 和 PB。分组：对照组、H2O2 组
                超氧阴离子，可与WST⁃8试剂反应产生黄色的甲赞                         （200 μmol/L）、H2O2+PB（20 μg/mL）组。按ALP显色
                产物，使用Spectra Max 190 酶标仪在450 nm处测量                试剂盒说明书配好染液后，每孔加入 1 mL 染液，室
                该黄色甲赞产物的D值。                                       温避光孵育 30 min，PBS 轻洗 2 遍，扫描仪拍照，倒

                    超氧化物清除活性=［（D 对照组-D 样本组）/D 对照组］×               置显微镜下观察。
                100%。                                                 另取同样成骨诱导 7 d 后的细胞，每孔加入
                    取5个15 mL离心管，按1∶8的比例分别加入不                      120 μL 0.5% TritonX⁃100冰上裂解20 min，超声后离
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