Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第6期
·766 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年6月
前1 d种于25 cm 细胞培养瓶中，24 h后更换培养基 V⁃Alexa Fluor 647，混匀后 4 ℃孵育 15 min。避光每
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为2.5 mL含病毒的β⁃TC6完全培养基，4 h后补足培 管加入 5 μL 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色液
养基至 5 mL。转染 24 h 后，每 24 h 更换新鲜培养 后，立即用流式细胞仪检测。
基。细胞生长至70%融合度时进行传代。传代后用 1.2.9 TdT介导的dUTP缺口末端标记技术（terminal
含4 μg/mL嘌呤霉素的β⁃TC6完全培养基筛选稳转株。 dUTP nick⁃end labeling assay，TUNEL）检测细胞凋亡
1.2.4 qRT⁃PCR检测 β⁃TC6 细胞按 3×10 个/孔接种于 96 孔板中，给
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用 Trizol 提 取 细 胞 总 RNA，测 量 浓 度 后 取 予处理后，PBS洗涤2次，每孔加入50 μL 4%多聚甲
500 ng RNA 逆转录合成 cDNA。cDNA 用 DEPC 水 醛于 4 ℃固定 30 min，PBS 洗涤后，0.2%TritonX⁃100
1∶5 稀释后，根据 SYBR Green Realtime PCR Master 室温孵育20 min，PBS洗涤后，TUNEL平衡缓冲液孵
Mix qPCR 说明书冰上制备PCR 反应液，在StepOne⁃ 育 5 min，弃去缓冲液，加 50 μL TUNEL 反应混合液
Plus 实时荧光定量 PCR 仪器上进行实时荧光定量 37 ℃避光反应1 h，PBS洗涤后，每孔加入30 μL DAPI
PCR 反应，95 ℃10 s 预变性；95 ℃ 5 s、60 ℃ 1 min， 室温孵育10 min，PBS洗涤后加入甘油封片，避光用
40个循环；95 ℃ 15 s、60 ℃ 1 min、15 ℃ 1 s。以空白 倒置荧光显微镜拍照。
对照组为内参，目的基因相对表达量以ΔCT表达。 1.3 统计学方法
1.2.5 Western blot检测 所有样本均独立重复3次。采用SPSS 26.0软件
RIPA 裂解液冰上提取细胞蛋白，用增强型 分析统计所得数据，用均数±标准差（x ± s）表示。独
BCA 蛋白浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白煮 立样本t检验用于两组数据间比较，多组比较采用单
沸变性后，取30 μg样品进行10% SDS⁃PAGE凝胶电 因素方差分析，P < 0.05为差异有统计学意义。
泳 2 h，湿转法将蛋白转印至 PVDF 膜，5%脱脂牛奶
2 结 果
室温封闭2 h后，加入一抗4 ℃孵育过夜。TBST洗涤
后加入HRP标记的二抗，室温孵育1 h，TBST洗涤后 2.1 β⁃TC6 细胞中 ASS1 敲低和过表达体系的构建
ECL发光液显影，凝胶成像仪曝光蛋白条带。 及验证
1.2.6 CCK⁃8实验 将 si⁃ASS1 和 si⁃NC 转染到β⁃TC6 细胞 48 h 后
将β⁃TC6 细胞按 3×10 个/孔接种于 96 孔板中， （转染效率约80%），收集细胞检测ASS1 mRNA和蛋
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给予处理后更换新鲜培养基，每孔加入10 μL CCK⁃8 白表达水平。结果显示，转染 si⁃ASS1 的细胞中，
检测液，于培养箱中孵育 1.5 h，用酶标仪在 450 nm ASS1 mRNA和蛋白水平明显降低（图1A~C）。
波长测每孔吸光度，计算细胞增殖活力。细胞活力= 采用慢病毒载体构建ASS1过表达稳转株后，收
（A 干 预-A 空 白）/（A 对 照-A 空 白）×100%（A 干 预：含细胞、 集细胞检测 ASS1 mRNA 和蛋白表达水平。结果显
CCK8溶液和药物溶液的孔的吸光度值；A 空白：含培养 示，ASS1过表达细胞中，ASS1 mRNA 和蛋白水平显
基和CCK8溶液而没有细胞的孔的吸光度值；A 对照：含 著升高（图1D~F）。
细胞、CCK8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度值）。 2.2 ASS1低表达和高表达对β⁃TC6细胞增殖的影响
1.2.7 5⁃乙炔基⁃2′⁃脱氧尿嘧啶核苷（5⁃ethynyl⁃2′⁃ 与 si⁃NC 组比较，敲低 ASS1 后β⁃TC6 细胞 EdU
deoxyuridine，EdU）法检测细胞增殖 阳性细胞率减少（P＜0.05，图2A、B），细胞增殖活力
β⁃TC6 细胞按 3×10 个/孔接种于 96 孔板中，给 下降（P < 0.05，图 2C）。与 OE⁃NC 组比较，过表达
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予处理后更换为含 50 μmol/L EdU 的完全培养基， ASS1 后β⁃TC6 细胞 EdU 阳性细胞率和细胞增殖活
于培养箱中孵育 2 h，PBS 洗涤后，用 4%多聚甲醛 力无明显差异（图3）。
室温固定 30 min，0.5%的 Tritonx⁃100 于摇床上孵育 2.3 ASS1低表达和高表达对β⁃TC6细胞凋亡的影响
10 min，PBS 洗涤后，加入 Apollo 染色反应液室温避 与si⁃NC组比较，敲低ASS1后β⁃TC6细胞TUNEL
光孵育30 min，0.5%的Tritonx⁃100清洗后，甲醇清洗 阳性细胞率和凋亡细胞比例明显增加（P < 0.05，
1次，PBS洗涤后用荧光显微镜拍照观察。 图 4）。与 OE⁃NC 比较，过表达 ASS1 后β⁃TC6 细胞
1.2.8 AV/PI检测 TUNEL 阳性细胞率和凋亡细胞比例下降（P < 0.01，
收集干预后的全部细胞至离心管中，PBS 清洗 图5）。上调ASS1可抑制β⁃TC6细胞凋亡。
后，加入195 μL Annexin V⁃Alexa Fluor 647结合液重 2.4 ASS1低表达对β⁃TC6细胞中AIF信号通路影响
悬细胞并转移至流式管中，每管加入 5 μL Annexin 为了探究 ASS1 对β⁃TC6 细胞增殖和凋亡作用
