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第43卷第6期 符 喆，陈        欢，陈 琰，等. 低频耳电针调节糖尿病胃轻瘫大鼠胃动力及共病抑郁机制的实验研究［J］.
                  2023年6月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：795-801                        ·797 ·


                续波，频率 2 Hz，电流强度 0.5~1.0 mA，每次电针治                  本）95 ℃预孵化 5 min，95 ℃ 10 s、60 ℃ 10 s、72 ℃
                疗 30 min，每日 1 次，1 周 5 日，连续 2 周。假耳针组               10 s的40个扩增循环。引物序列见表1。
                用针灸针刺激双侧耳垂，无电刺激。
                                                                                 表1 qPCR引物序列
                1.2.3 行为学检测
                                                                            Table 1  qPCR primer sequences
                1.2.3.1 旷场实验
                                                                                                        片段长度
                    在温和照明条件下的隔离无噪音房间中放置                            引物名称           引物序列（5′→3′）
                                                                                                         （bp）
                一个由黑色聚丙烯制成的旷场实验箱（100 cm ×
                                                                   c⁃Kit⁃F   ATCAGGGCGACTTCAATTACG        254
                100 cm × 40 cm）。将大鼠轻轻放置在场地中央，并
                                                                   c⁃Kit⁃R   CTGCTGGTGTTCAGGTTTAGGG
                允许探索场地 5 min。大鼠运动轨迹由安装在实验                          CRF⁃F     GAAGAGAGCGCCCCTAACAT         242
                箱中心上方的摄像机记录，并使用 ANY⁃Maze 视频                        CRF⁃R     GCGGGACTTCTGTTGAGGTT
                跟踪系统（Stoelting 公司，美国）进行分析。计数并                      β⁃actin⁃F  TGCTATGTTGCCCTAGACTTCG      240
                计算每只大鼠进入中央区域时间百分比（CT%）、进                           β⁃actin⁃R  GTTGGCATAGAGGTCTTTACGG
                入中央区域次数（CE）及进入中央区域距离百分比
               （CD%）。在每次测试结束时，用70%乙醇清洁实验                          1.3  统计学方法
                箱以消除嗅觉线索。                                             使用 GraphPad Prism 8.0 软件对数据进行统计
                1.2.3.2 强迫游泳实验                                    分析和绘图。对于符合正态分布的计量资料，数据
                    将每只大鼠放入装有水的有机玻璃圆柱体（直径                         采用均值±标准误（x ± sx ）表示，两组之间采用t检验
                20 cm、高50 cm）中，水温为 23~25 ℃、水深 40 cm，让             进行比较，3组之间采用Tukey事后检验的单因素方
                大鼠强迫游泳 10 min，记录其后 8 min 内的漂浮时                    差分析进行比较；对于不符合正态分布的数据，两
                间。全程对实验过程进行录像，并由 SuperFst 高通                      组之间采用 Mann⁃Whitney 非参数检验，3 组之间采
                量强迫游泳实验软件分析大鼠的漂浮时间，计算大                            用 Kruskal⁃Wallis 非参数检验。P < 0.05 为差异有
                鼠漂浮时间百分比（FT%）。游泳结束后，将大鼠擦                          统计学意义。
                干后放入干净鼠笼内。
                                                                  2  结 果
                1.2.4 固体胃排空测试
                    在行为学实验结束后，禁食过夜，10 min内给所                      2.1  耳电针对糖尿病胃轻瘫大鼠行为学的影响
                有大鼠喂食2 g食物。30 min后迅速处死大鼠，收集                           在旷场实验中（图1），与空白对照组比较，模型
                整个胃内容物放入容器中并风干72 h。测量胃内容                          组大鼠 CE、CD%和 CT%均明显降低（均 P < 0.05）；
                物的干重，并使用以下公式计算胃排空的百分比：                            与模型组比较，耳电针组CE、CD%和CT%值明显升
                胃排空率=（喂食食物克数-干胃内容物克数）/喂食                          高（均 P < 0.05）；模型组与假耳针组 CE、CD%和
                食物克数×100%。                                        CT%值差异均无统计学意义（均 P > 0.05）；与耳电
                1.2.5 酶联免疫吸附实验（ELISA）                             针组比较，假耳针组CE值差异无统计学意义，CD%
                    取胃窦组织，加入含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶                          和CT%值明显降低（均P < 0.05）。
                抑制剂的 RIPA 裂解液，置于冰上裂解 30 min，4 ℃                       在强迫游泳实验中（图2），与空白对照组比较，
                下 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液，BCA 试剂盒             模型组大鼠 FT%明显升高（P < 0.05）；与模型组比
                测定蛋白浓度。随后根据 ELISA 检测试剂盒（江苏                        较，耳电针组FT%值明显降低（P < 0.05）；模型组与
                晶美生物科技有限公司）中说明书测定样品中酪氨                            假耳针组 FT%值差异无统计学意义（均 P > 0.05）；
                酸激酶受体（c⁃Kit）、CRF的含量。                              与耳电针组比较，假耳针组FT%值明显升高（均P <

                1.2.6 实时荧光定量PCR                                   0.05）。
                    使用 RNAiso Plus（TaKaRa 公司，日本）提取胃               2.2  耳电针对糖尿病胃轻瘫大鼠固体胃排空率的
                窦 总 RNA，并 通 过 NanoDrop 2000 分 光 光 度 法             影响
               （Thermofisher 公司，德国）测量和确定 RNA 的纯                       与空白对照组比较，模型组大鼠胃排空率显著

                度。使用 ABI 7300 快速实时 PCR 系统（Applied                 降低（P＜0.01）；与模型组比较，耳电针组大鼠胃排
                Biosystems 公司，美国）进行实时定量 PCR，循环条                   空率显著升高（P＜0.01），假耳针组大鼠胃排空率也
                件如下：用SYBR Premix Ex Taq （TaKaRa 公司，日              有明显升高（P＜0.01）；与耳电针组比较，假耳针组
                               ®
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