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第43卷第7期         黄梓熙，孟 琳，陈良标，等. 斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除对心血管发育的影响［J］.
                  2023年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：900-908                       ·903 ·


                表示。通过 t 检验比较两组间差异。P < 0.05 为差                     胎，取发育至 96 hpf 的 F0 胚胎基因组 PCR 纯化产
                异有统计学意义。                                          物进行测序，并采用 1.5% 琼脂糖凝胶电泳检测，
                                                                  突变型在 220 bp 处出现 1 个条带，野生型无条带。
                2 结    果
                                                                  F0 斑马鱼性成熟后与野生型斑马鱼杂交产生 F1
                2.1  CRISPR/Cas9构建Hb 突变体                          代，3 个月后对其剪尾鉴定，将 PCR 纯化产物进行
                                       +/-
                    将 CRISPR/Cas9 靶点分别设计在 hbba2 基因第               测序，经序列比对及琼脂糖凝胶电泳分析（图 2），
                2 外显子和 hbae3 基因第 2 外显子的反义链上。将                     表明成功筛选出从 hbba2 到 hbae3 缺失的杂合突
                Cas9 蛋白和 gRNA 混合注入一细胞期的斑马鱼胚                       变体。



                                          M  F0    WT                         M  WT F1   WT
                                  5 000 bp
                                  3 000 bp
                                  2 000 bp                             2 000 bp
                                  1 500 bp
                                  1 000 bp                             1 500 bp
                                    750 bp                             1 000 bp
                                                             F0×WT      750 bp
                                    500 bp
                                                                        500 bp
                                                                        250 bp
                                    250 bp
                                                                        100 bp
                                    100 bp
                                                图2   可遗传的F0代及F1代突变体筛选
                                        Figure 2 Screening of heritable F0 and F1 generation mutants


                2.2  对斑马鱼胚胎血红蛋白水平的影响                              WT均发育迟缓（图5A~C），腹部大血管发育迟缓的
                    选取多个时间点对斑马鱼胚胎进行固蓝染                            情况一直持续到36 hpf（图5D），但48 hpf后，Hb 与
                                                                                                             +/-
                色。24 hpf WT斑马鱼显示少数o⁃Dianisidine阳性细                WT 斑马鱼的血管发育趋近一致，且未能观察到明
                        +/-
                胞，而Hb 未有阳性显示；28、30、33、36 hpf时与WT                  显的差异。与 WT 的血管发育相比，48 hpf 时 Hb                +/-
                斑马鱼相比，Hb 血红蛋白明显减少（图 3A~D），                        的节间血管（intersegmental vessel，ISV）横向分支发
                               +/-
                36 hpf 时 WT 斑马鱼胚胎在心脏位置显示强烈的                       育缓慢（图5E），3 dpf时Hb 的肠下静脉（subintesti⁃
                                                                                          +/-
                染色阳性，相反，Hb 只有个别胚胎在该位置显示                           nal vein，SIV）发育更快（图 5F）；4~7 dpf Hb 的 ISV
                                                                                                         +/-
                                  +/-
                阳性；当斑马鱼胚胎发育至48 hpf以后，血红蛋白的                        发育异常，且观察到尾部出现了血管增生，Hb 比
                                                                                                            +/-
                表达量趋近一致，从染色结果来看，WT 斑马鱼胚                           WT多1对ISV（图5G）；背长轴血管（dorsal longitudi⁃
                                               +/-                nal anastomotic vessel，DLAV）在整个发育过程中并
                胎的血红蛋白在腹部的分布比 Hb 更分散，50 hpf
                可以明显观察到血红蛋白的异位表达，WT 的血红                           未受到影响。另外，Hb 和 WT 的腹部和背部的拍
                                                                                       +/-
                蛋白主要分布在斑马鱼上腹部横向斑纹的上方，                             照结果并未显示差异。
                而在 Hb 中主要分布于其下方（图 3E）。                            2.5  成鱼心脏转录组分析结果及qRT⁃PCR验证
                       +/-
                2.3  对成年斑马鱼红细胞发育的影响                                   为了阐明血红蛋白基因大片段敲除影响心血
                    对 5 月龄 Hb 和 WT 成年斑马鱼红细胞计数，                    管发育的机制，我们使用 RNA 测序对 Hb 心脏和
                                                                                                        +/-
                               +/-
                结果表明两者之间的红细胞数量没有显著差异                              WT心脏进行了转录组分析。在Hb 斑马鱼心脏中
                                                                                                  +/-
               （P > 0.05），但是将雌、雄斑马鱼的红细胞数量分开                       共鉴定出1 675个差异表达基因，包括794个上调基
                统计对比发现，Hb 雌鱼红细胞数量增多、雄鱼红细                          因和881个下调基因（图6A）。hbba2是下调幅度最
                                +/-
                胞数量减少（P均<0.05，图4）。                                大的基因之一。用上调和下调的基因生成了热图
                2.4  对斑马鱼胚胎血管发育的影响                                以说明 Hb 斑马鱼心脏的转录谱（图 6B）。KEGG
                                                                            +/-
                                                            +/-   注释的分子通路分析显示，血红蛋白敲除影响氧化
                    将血管标记转基因斑马鱼（kdrl：EGFP）与 Hb
                杂交后收集受精卵，28 ℃恒温培养至24 hpf，挑选带                      磷酸化、心肌收缩、HIF1 信号通路和坏死性凋亡等
                有绿色荧光的血管标记的胚胎继续培养。结果显                             通路（图6C）。血红蛋白水平降低，导致心脏供氧不
                示，28、30、32 hpf Hb 斑马鱼胚胎腹部与心脏相接的                   足，缺氧诱导因子HIF1信号通路中诱导型一氧化氮
                                 +/-
                主血管及共同基静脉（common cardinal vein，CCV）较              合酶（NOS2/iNOS）编码基因 nos2b 显著上调以及缺
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