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第43卷第7期         黄梓熙，孟 琳，陈良标，等. 斑马鱼3号染色体血红蛋白基因敲除对心血管发育的影响［J］.
                  2023年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：900-908                       ·901 ·


                    心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）的患           1.2.2  CRISPR/Cas9敲除
                                                                                           ［7］
                病率近年来逐步提升，已经成为我国重大公共卫生                                利用 CRISPR/Cas9 技术 对斑马鱼 3 号染色体
                问题，每年有2/5的死亡可归因于CVD 。除此之外，                        上编码血红蛋白的基因片段 hbba2 到 hbae3 进行双
                                                 ［1］
                CVD的治疗费用也十分高昂，并且仍在不断增长                    ［2-3］ 。  靶点敲除（图1）。基因敲除后利用基因组DNA提取
                因此，CVD 的影响因素和治疗方法都需要深入研                           试剂盒提取 DNA，进行基因组扩增。参照 NCBI 上
                究。红细胞是运输氧气的载体，血红蛋白在机体内                            斑马鱼基因序列设计引物，并在上海生工公司进行
                发挥着重要的作用，虽然血红蛋白水平和CVD之间                           合成。分别使用 3 对引物进行 PCR 扩增，鉴定斑马
                的关系仍不明确，但是它与携氧量、血流量及某些炎                           鱼的基因型。鉴别结果可分为以下 3 种情况，①使
                症过程相关，而有研究显示，血红蛋白水平和 CVD 之                        用第 1 对引物进行扩增：上游引物 H6⁃1⁃F（5′⁃GT⁃
                间的关系并不是线性关系 ，而是呈 U 型相关 ，                          GAAAGGGTGCTGGTTGTT⁃3′）；下游引物 H5⁃12⁃R
                                        ［4］
                                                           ［5］
                因此血红蛋白水平增高或降低都可能与 CVD 有密                         （5′⁃TTAGCTTGCAGAGAGACGGA⁃3′）。扩增后无
                切的关系 ，目前对于血红蛋白水平调控心血管发                            条带则为野生型（WT）斑马鱼；若扩增出220 bp的条
                        ［6］
                育的机制研究较少。                                         带，则说明此斑马鱼为杂合子（Hb ）或纯合子
                                                                                                    +/-
                    斑马鱼基因与人类具有高度的同源性，本研                          （Hb ），接着再分别使用HB⁃2⁃F1（5′⁃CAAAGCTTA⁃
                                                                      -/-
                究充分利用斑马鱼易于繁殖、便于在体观察的                              AATGTTCGTGC⁃3′）、HB⁃2⁃R1（5′⁃CGATGACAAT⁃
                特点以及现有成熟的基因操纵技术，首次在斑                              GCTCAGGCAGTC⁃3′）和 H5⁃2⁃F（5′⁃GCGTTCAAA⁃
                马鱼中使用 CRISPR/Cas9 技术对 3 号染色体上血                    ACAATGCTCTTC⁃3′）、H5⁃2⁃R（5′⁃GGGTAAACGAA⁃
                红蛋白基因从 hbba2 到 hbae3 的片段进行敲除，对                    CAAAGTCCTGTAAA⁃3′）两对引物扩增；②若扩增
                基因敲除后斑马鱼的血红蛋白水平及不同时期心                             出472 bp和393 bp的目的条带，则此斑马鱼为杂合
                血管发育进行研究，以阐明血红蛋白水平变化影                             子（Hb ）；③若扩增不出 472 bp 和 393 bp 的目的条
                                                                        +/-
                响心血管发育的分子机制，为 CVD 的防治提供新                          带，则此斑马鱼为纯合子（Hb ）。PCR 扩增的反应
                                                                                            -/-
                思路。                                               条件为：95 ℃下预变性 5 min；95 ℃下变性 30 s，
                                                                  62 ℃（/58 ℃/55 ℃）下退火 30 s，72 ℃下延伸 30 s，共
                1 材料和方法
                                                                  进行 35 个循环；最后在 72 ℃下再延伸 5 min。PCR
                1.1  材料                                           产物使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳成像。
                    邻联茴香胺（o⁃Dianisidine）粉末（Sigma公司，美              1.2.3  固蓝染色
                国）；rTaq 酶、PrimeScript TM  RT Master Mix 试剂盒、          血 红 蛋 白 催 化 过 氧 化 氢 释 放 出 氧 后 会 使
                TB Green Premix Ex Taq （TaKaRa 公司，日本）；            o⁃Dianisidine 呈现出铁锈的颜色，根据这一特性，使
                        ®
                                       TM
                PBS 缓冲液、甲基纤维素（北京索莱宝）；Tween⁃20、                    用o⁃Dianisidine 检测受精卵中血红蛋白的含量及分
                醋酸钠、无水乙醇、甘油（上海生工）；30%过氧化氢                         布情况。
                                                                                   ［7］
               （上海国药试剂）；4% PFA（上海 Lab Top）；TRIzol                     配制固蓝染液 ：取0.36 mg o⁃Dianisidine粉末、
               （Ambion公司，美国）。                                     13 μL 30%过氧化氢、2 μL 3 mol/L 醋酸钠（pH4.5）、
                1.2  方法                                           240 μL无水乙醇，使用ddH2O定容到600 μL。
                1.2.1  斑马鱼饲养                                          将敲除得到的杂合突变体斑马鱼（Hb ）以及野
                                                                                                       +/-
                    AB品系野生型斑马鱼（购于中科院遗传与发育                         生型斑马鱼（WT）雌雄各一对分别进行自交，所产受
                生物学研究所）及kdrl：EGFP转基因斑马鱼（购于国                       精卵收集于不同的培养皿中，同时记录产卵时间，
                家斑马鱼资源中心）在上海海圣斑马鱼养殖循环系                            随后置于28 ℃ 恒温培养箱中培养。分别取24、28、
                统中按照标准方法饲养。养殖水循环水温控制在                             30、33、36、48、52 hpf Hb 和WT斑马鱼胚胎（n=30），
                                                                                       +/-
                28 ℃，pH值为7.4±0.2，自动进行暗/光循环（10 h/14 h）。            早期胚胎未出膜时，需先将卵膜剥离再进行染色。
                通过自然配对交配获得斑马鱼胚胎，并将其保存在                            使用 o⁃Dianisidine 染液室温染色 15 min，全程避光，
                装有养殖水的培养皿中，置于28 ℃恒温培养箱。斑                          随后用PBST漂洗3次，每次漂洗3 min，漂洗完成后
                马鱼胚胎的年龄以受精后小时数或天数（hpf或dpf）                        将受精卵置于 4% PFA 中固定超过 6 h，PBST 再漂
                表示。所有实验操作均经上海海洋大学动物伦理                             洗 3 次，每次 3 min，放置在 100%的甘油中，显微镜
                委员会批准。                                            观察染色情况并拍照。
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