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第43卷第7期 游铭钰，周 欢，张宇涵，等. hsa_circ_0005389在新生儿急性呼吸窘迫综合征细胞炎症模型
2023年7月 中的作用研究［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：945-953 ·947 ·

效果，上清为细胞质，沉淀为细胞核，分别提取细胞 表1 RT⁃qPCR引物
质 RNA、细胞核 RNA，提取后的 RNA 进行逆转录以 Table 1 RT⁃qPCR primers
及RT⁃qPCR用于检测hsa_circ_0005389在细胞质以 基因 引物序列（5′→3′）
及细胞核中的相对表达量。 hsa_circ_0005389 上游：AGTCCATTCCACGCCTAC
1.2.3 荧光原位杂交 下游：GAGCACGATCACGAACAT
PI3K 上游：TGGTTTGGATCTTCGGATGT
从上海吉玛制药技术有限公司处购得带Cy3荧
下游：GCCAGCACAGGACAGTGTAA
光的 hsa_circ_0005389 探针及试剂盒，按照说明书
Akt 上游：TCACCATCACACCACCTGAC
完成此实验。
下游：CTCAAATGCACCCGAGAAAT
将适当数量的 A549 细胞接种于 48 孔板，24 h IL⁃6 上游：CCTTCCAAAGATGGCTGAAA
后 PBS 洗涤 2 次，每孔加入 100 μL 0.1% Buffer A， 下游：AGCTCTGGCTTGTTCCTCAC

室温孵育 15 min，PBS 洗涤 2 次后加入 100 μL 2× IL⁃8 上游：TGCAGCTCTGTGTGAAGGTG
Buffer C，37 ℃培养箱放置 30 min；Buffer E 在 73 ℃ 下游：ACTTCTCCACAACCCTCTGC
水浴锅孵育 30 min 后加入稀释后的探针中，继续 sTNFR1 上游：GAGAGGCCATAGCTGTCTGG
下游：GCACTTGGTACAGCAAATCG
73 ℃变性 5 min；吸弃 Buffer C，每孔加入 100 μL 探
GAPDH 上游：GAACGGGAAGCTCACTGG
针混合液，避光 37 ℃培养箱杂交过夜；次日吸弃探
下游：GCCTGCTTCACCACCTTCT
针混合液，每孔加入100 μL 42 ℃预热的0.1%Buffer
F洗涤5 min，每孔加入100 μL 42 ℃预热的2×Buffer 1.3 统计学方法
C 洗涤 5 min，吸弃 Buffer C 后进行 DAPI 避光染色 使用 SPSS 17.0 和 GraphPad Prism 9.0 版软件对
20 min，PBS洗涤2次，置于显微镜下观察。 数据进行分析。各种实验均重复至少 3 次，定量数
1.2.4 细胞增殖与凋亡测定 据以平均值 ± 标准差（x ± s）表示，3 组独立样本之
按照 1.2.1 中所述方法转染 siRNA、NC、Vector、 间的差异采用重复测量方差分析检验，SNK 法进行
过表达质粒，测定起始吸光度，待细胞生长（不加或 两两比较。P < 0.05为差异有统计学意义。
加入LPS）1、2、3 d后更换为无血清培养基且每孔加
2 结 果
10 μL CCK⁃8，孵育 1 h，测定 450 nm 处的吸光度。
另外，将已转染 A549 细胞再培养 48 h，收集上清后 2.1 A549细胞中hsa_circ_0005389的表征
消化离心至 5 mL EP 管，按照细胞凋亡试剂盒说明 检索从 circBase 数据库网站（http：//www.circ⁃
书步骤测定凋亡程度。 base.org/）及 circprimer 1.2.0.5 版软件可知 hsa_circ_
1.2.5 Western blot 0005389位于17号染色体，由多个外显子剪接而成，
使用 RIPA 裂解缓冲液从 A549 细胞中提取总 亲本基因为SLC38A10，包含409个碱基。为了进一
蛋白。将 5 μL 蛋白样品通过 10% SDS⁃PAGE 凝胶 步了解 hsa_circ_0005389，对未用 LPS 处理的 A549
分离并印迹在 PVDF 膜上，随后用 TBST 配制的 5% 细胞（空白组）与 LPS 处理的 A549 细胞（LPS 组）
脱脂奶粉溶液将膜封闭2 h阻断非特异性位点。加 进行 hsa_circ_0005389 荧光原位杂交分析，无论是
入抗 IL⁃6、抗 PI3K、抗 TNF⁃α和抗β⁃actin 4 ℃冰箱 空 白 组 还 是 LPS 组 均 提 示 hsa_circ_0005389 在
孵育过夜。次日 TBST 洗涤 3 次后用山羊抗兔 IgG A549 细胞中表达（图 1A），另结合核质分离实验
或山羊抗小鼠 IgG 孵育 1.5 h。最后加入 ECL 化学 提示 hsa_circ_0005389 主要在 A549 细胞质中表达
发光试剂，通过 Tanon 5200 Multi 仪器进行曝光扫 （图1B）。
描。 2.2 急性肺损伤细胞炎症模型的建立
1.2.6 实时定量PCR（RT⁃qPCR） 以LPS（10 μg/cm）作用于A549细胞不同时间，
2
2
用TRIzol提取A549细胞总RNA，通过NanoDrop 如图2A所示，A549细胞暴露于LPS（10 μg/cm）48 h
ND⁃1000 进行 RNA 质控，合格后进行逆转录。将 后，CCK⁃8结果显示与不加LPS的对照组比较，细胞
cDNA（1 μL）与按照 PCR 试剂盒说明书配制的反应 活力显著降低，差异有统计学意义（P < 0.01）。将

体系（4 μL）混合，于 LightCycler480II 仪器运行 PCR A549 细胞于不同浓度的 LPS 中暴露 48 h，图 2B~G
试剂盒程序，测定相应 mRNA 相对表达量（计算方 所示，10 μg/cm 处理组各炎性标志物和相关通路指
2
-ΔΔCT ）。所用引物序列见表1。 标的表达最高，与对照组比较，差异均具统计学意
法为2