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第43卷第7期
               ·946 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年7月


              significantly decreased（P < 0.05）after knocking down the expression of hsa_circ_0005389. Inflammatory markers and related
              pathway indexes decreased significantly（P < 0.001）in the acute lung injury model after knocking down the express of hsa_circ_
              0005389. The proliferation of A549 cells were accelerated and the apoptosis rate was decreased（P < 0.05）when the expression of
              hsa_circ_0005389 was down⁃regulated，while the proliferation of A549 cells was slowed down and the apoptosis rate was increased
              after hsa_circ_0005389 expression was over⁃regulated（P < 0.05）by using CCK⁃8 and flow cytometry as compared with the negative
              control group. Conclusion：In acute lung injury cell model，hsa_circ_0005389 promoted the expression of inflammatory markers of lung
              injury，affecting the proliferation and apoptosis of lung epithelial cells. These results suggested that hsa_circ_0005389 was involved in
              the inflammatory process of NARDS，which may be a potential intervention target.
             ［Key words］ hsa_circ_0005389；neonatal ARDS；circRNA；inflammation；lung injury
                                                                            ［J Nanjing Med Univ，2023，43（07）：945⁃953］




                  新生儿急性呼吸窘迫综合征（neonatal acute
                                                                1 材料和方法
              respiratory distress syndrome，NARDS）是一种以肺泡
              损伤和免疫细胞浸润为特征的、威胁生命的严重呼                            1.1  材料
              吸系统疾病，其病理特征是炎症增加微血管通透性                                 DMEM（南京凯基生物）；胎牛血清（BI 公司，
              导致肺泡内富含蛋白质的液体渗出，从而引发顽固                            南美）；青链霉素双抗、胰蛋白酶消化液、DEPC 水、
              性低氧血症 。该病于1989年被首次定义，2017年                        SDS⁃PAGE 凝胶试剂盒（上海碧云天）；PBS 缓冲液（南
                        ［1］
              Montreux 标准重新定义了NARDS，将其与新生儿呼                     京森贝伽）；Lipofectamine     TM  3000、TRIzol（Invitrogen
              吸窘迫综合征（neonatal respiratory distress syndrome，    公司，美国）；脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）（Sigma
              NRDS）和新生儿短暂性呼吸急促（transient tachy⁃                 公司，美国）；mRNA逆转录试剂盒、实时荧光定量试
              pnoea of the neonate，TTN）区分开来，为早期诊断提              剂盒、CCK⁃8 试剂盒（南京诺维赞）；ECL化学发光试
              供了依据    ［2-3］ 。目前对于 NARDS 的管理，主要采用                剂盒（合肥白鲨生物科技有限公司）；PI3K抗体（CST
              对因治疗，在施以呼吸支持和气管内注入肺泡表面                            公司，美国）；肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor α，
              活性剂治疗的基础上，积极寻找病因，对于肺内原                            TNF⁃α）抗体、β⁃actin 抗体（沈阳万类生物科技有限
              因应尽早查清病原体或吸入证据，对于肺外原因应                            公司）；白细胞介素（interleukin，IL）⁃6 抗体（北京
              及时给予多器官支持手段，实现治疗的整体性，真                            Proteintech公司）；山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG（北
              正改善预后      ［4-7］ 。NARDS 过程复杂，常伴有弥漫性               京中杉金桥生物技术有限公司）；流式细胞凋亡检
              肺泡损伤（diffuse alvelar damage，DAD）和全身炎症             测试剂盒（杭州联科生物公司）；RNA荧光原位杂交
              反应综合征，可以引起或加重肺上皮和血管内皮的                            试剂盒（上海吉玛基因生物有限公司）。
                        ［8］
              损伤和炎症 ，因此NARDS的早期诊断和及时治疗                          1.2  方法
              很重要。然而有关 NARDS 治疗的深入研究却滞后                         1.2.1  细胞培养和转染
              于成人和儿童。先前研究表明 NARDS 中存在差异                              人肺泡上皮细胞（A549）购自上海生命科学研
              表达的环状RNA（circular RNA，circRNA），并可能参               究院，在 6 孔板中加入添加 10%胎牛血清和青链霉
              与 NARDS 的发病机制；此外有研究表明，多种小                         素（100 U/mL）的 DMEM 培养液并放置于 37 ℃、5%
              RNA（microRNA，miRNA）参 与 NARDS 的 发 病 机              CO2 培养箱中培养。通过 Lipofectamine          TM  3000 将
              制，并在其病理过程中发挥着不同的作用                     ［9］ 。在     siRNA（si ⁃ hsa_circ_0005389）或 其 阴 性 对 照 序 列
              先前的研究中，本课题组对患有NARDS以及仅患有                          （NC）3.75 μL、过表达质粒或其对照 Vector（2.5 μg）
              高胆红素血症的新生儿血标本进行人类高通 量                             转染A549细胞。24 h后更换完全培养基，培养48 h
              circRNA微阵列分析，发现hsa_circ_0005389在两组                或加 LPS 培养 48 h。siRNA、NC、Vector 及过表达质
              间的表达差异 23.9 倍，并且在 NARDS 患儿组中表                     粒均购于上海吉玛基因生物有限公司。
              达量增加    ［10］ 。故本研究在人类circRNA高通量芯片                 1.2.2  核质分离
              测 序 和 相 关 生 物 信 息 学 分 析 的 基 础 上 研 究                    将A549用1 mL PBS重悬后留取200 μL作为对
              hsa_circ_0005389 与 NARDS 之间的联系，以期为                照组，剩余细胞用液氮速冻，37 ℃水浴快速溶解，反
              NARDS的治疗提供新方向。                                    复 3 次后离心，辅以不同蔗糖密度梯度达到分离的
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