Page 82 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第7期
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              30 min。eBlot L1 快速湿转仪将蛋白转移至 PVDF                  正态分布的计量资料以均值±标准差（x ± s）表示，
              膜，5%牛血清蛋白常温孵育 2 h，兔抗人 ZIP8 多                      SNK⁃q检验比较两组间差异。满足PH假设检验后，
              克隆抗体（1∶1 000）或兔抗人 GAPDH 单克隆抗                      通过Cox比例风险回归模型确定预后因素。生存曲
              体（1∶2 000）4 ℃孵育过夜。次日 PBST 漂洗 3 次，                 线绘制采用 Kaplan⁃Meier 法，生存曲线比较采用时
              每 次 5 min。辣根过氧化物酶标记的羊抗兔 IgG                       序检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
             （1∶5 000）常温孵育1 h，PBST漂洗3次，每次5 min。
                                                                2 结     果
              Pierce ECL 曝光液覆盖 PVDF 膜表面，置于 Tanon
              5200S曝光仪曝光并拍照。Image J测定蛋白条带灰                      2.1  耐药蛋白的筛选
              度值。以上实验重复3次。                                           通过比较HCT116、HT29和LoVo耐药细胞株与
              1.2.5  CCK⁃8细胞增殖试验                                非耐药株的基因差异，筛选出 4 个结肠癌细胞耐药
                  将siNC组和siZIP8组细胞分别按5×10 个/孔的                  后 共 同 的 差 异 基 因 ZIP8、NUPR1、SLC43A1 和
                                                     4
              密度种植于 96 孔板，待细胞贴壁后，加入不同浓度                         TEME73（图 1A）。使用 Ualcan 数据库检测 ZIP8、
              的 奥 沙 利 铂（终 浓 度 分 别 为 0、1.25、2.50、5.00、           NUPR1、SLC43A1 和 TEME73 基因在结肠组织中

              10.00、20.00 μg/mL），不同浓度设 3 个复孔。48 h               的表达及其与患者预后的关系，发现 ZIP8 在结肠
              后去除原培养基，每孔加入 10 μL CCK⁃8 溶液和                      癌组织（n=275）中表达水平显著高于正常肠组织
              90 μL DMEM培养基，37 ℃避光孵育2 h，酶标仪检测                   （n=349）（P < 0.05，图 1B），且仅 ZIP8 高表达的结肠
              各孔在 450 nm 波长处的吸光值。该实验重复3 次。                      癌患者预后较差（P=0.005，图1C），因此将ZIP8作为
              1.2.6  细胞凋亡检测                                     进一步研究对象。
                  将处于对数生长期的SW620细胞按5×10 个/孔                     2.2  干扰SW620细胞的ZIP8表达
                                                       4
              的密度种植于 6 孔板，待细胞生长至 50%密度时加                             将 siRNA⁃ZIP8 转染至结肠癌细胞株 SW620，
              入终浓度为 5 μg/mL 的奥沙利铂，48 h 后消化收集                    通过检测 ZIP8 的表达情况观察 siRNA⁃ZIP8 的干扰
              细胞，500 g 离心 5 min，PBS 缓冲液重悬细胞，重复                  效率，qPCR 结果显示 siZIP8 组细胞的 ZIP8 mRNA
              3 次。去上清，根据 Annexin V⁃APC 细胞凋亡检测                   水平较 siNC 组显著下降，差异具有统计学意义
              试剂盒说明书，加入 500 μL Binding Buffer 重悬细               （P < 0.05，图 2A）。Western blot 结果显示，相较于
              胞，加入 5 μL Annexin V⁃APC 染液混匀，避光室温                 siNC 组细胞，siZIP8 组细胞的 ZIP8 蛋白表达明显降
              孵育 5 min，BD FACS AriaⅡSORP 分选型流式细胞                低（P < 0.05，图2B）。以上结果表明，siRNA⁃ZIP8可
              仪检测。该实验重复3次。                                      以下调SW620细胞的ZIP8表达。
              1.2.7  免疫组织化学染色（IHC）分析                            2.3  干扰 ZIP8 表达可增强奥沙利铂对结肠癌细胞
                  所有组织标本均采用 10%中性缓冲福尔马林                         的增殖抑制
              溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm 切片。采用 SP 法                            通过 CCK⁃8 实验检测 siNC 组和 siZIP8 组在奥
              对结肠组织样本进行 IHC 染色，详细步骤参见                           沙利铂处理后细胞增殖情况的变化。如图 3 所示，
              Histostain SP免疫组化染色试剂盒说明书。                        在相同药物浓度下，siZIP8 组细胞增殖抑制率高
                  阅片由 2 位病理科医师双盲独立完成，采用半                        于 siNC 组（P < 0.05，图 3）。经计算得出，奥沙利
              定量H⁃score方法对Trop2表达进行评分。采用如下                      铂 对 siZIP8 组 的 半 数 抑 制 浓 度（IC50 ）为（1.926±
              染色强度评分：0分表示阴性；1分为弱阳性；2分为                          0.103）μg/mL，低于 siNC 组［（5.156±0.147）μg/mL］，
              中度阳性；3 分为强阳性。每个强度级别的细胞总                           差异有统计学意义（P < 0.05）。结果表明，ZIP8 表
              数乘以相应的强度评分，得到强度百分比评分。然                            达被干扰后，奥沙利铂对结肠癌细胞增殖的抑制作
              后将 4 种强度百分比评分相加，计算最终染色评                           用得到增强。
              分。最终染色评分最低为 0 分（无染色），最高为                          2.4  干扰 ZIP8 表达可促进奥沙利铂治疗后结肠癌
              300 分（所有细胞均为强阳性）。使用 X⁃tile 软件程                    细胞的凋亡
              序确定临界值，0~130 分认为 ZIP8 蛋白低表达，                           通过流式细胞术检测 siNC 组和 siZIP8 组细胞
              131~300分认为ZIP8蛋白高表达。                              在奥沙利铂处理后凋亡情况的变化。未加药培养
              1.3  统计学方法                                        时 siNC 组 和 siZIP8 组 细 胞 的 总 凋 亡 率 分 别 为
                  使用SPSS 22.0统计软件对数据进行分析，符合                     （2.413±0.535）%和（4.213±0.716）%，奥沙利铂处理
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