Page 81 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 81

第43卷第7期               李艳梅，王     超，张    宁，等. 锌转运体8对结肠癌奥沙利铂耐药的影响［J］.
                  2023年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（07）：966-973                       ·967 ·


                    结肠癌是全球肿瘤相关死亡的第三大原因，也                          准（YKD202001250），所有患者及家属均签署知情
                                           ［1］
                是我国最常见的恶性肿瘤之一 。非转移性结肠癌                            同意书。
                一经诊断，约 80%的患者可以手术切除，但 30%~                        1.2  方法
                50%的预后不良患者出现术后复发 。因此，对于                           1.2.1  耐药相关基因筛选
                                                ［2］
                高危Ⅱ期或Ⅲ期结肠癌患者，手术切除后需要进行                                从 NCBI⁃GEO 数据库（https：//www.ncbi.nlm.nih.
                辅助化疗，以降低复发风险 。                                    gov/gds）下载微阵列数据集GSE42387。该数据集包
                                        ［3］
                    奥沙利铂是第三代铂类辅助化疗药物，主要通                          含HCT116、HT29和LoVo及相对应奥沙利铂耐药细
                过抑制DNA 复制进而诱导细胞凋亡 。据报道，奥                          胞株的 mRNA 微阵列信息。本研究通过 GEO2R 工
                                                ［4］
                                                       ［5］
                沙利铂可有效改善Ⅲ期结肠癌患者的预后 。然                             具对耐药细胞株和未处理细胞株的数据进行再分
                而，临床治疗中结肠癌患者会出现原发性或继发性                            析，筛选出4种细胞株共同的耐药基因。采用t检验，
                奥沙利铂耐药，限制了奥沙利铂的治疗效果。因                             以 P < 0.05 和|log2差异倍数（fold change，FC）|> 1 为
                此，探究奥沙利铂耐药相关靶点及机制符合临床治                            判定标准定义各数据集中有统计学意义的差异基
                疗的迫切需求。                                           因。
                    本研究通过生物信息学方法筛选出结肠癌细                           1.2.2  细胞培养与转染

                胞 中 奥 沙 利 铂 耐 药 相 关 基 因 锌 转 运 体 8（zinc                常规复苏人结肠癌细胞株 SW620，使用含 10%
                transporter 8，ZIP8）。ZIP8，又称溶质载体家族39成              胎牛血清和1%双抗的 DMEM培养基培养。细胞置
                员8（solute carrier family 39 member 8，SLC39A8），是   于 37 ℃、5% CO2的恒温生物培养箱，每 2~3 d 更换
                一种转运二价金属离子的膜蛋白，属于锌离子转运                            培养基。待细胞融合度达到 90%，0.25%胰蛋白酶
                蛋白家族，其异常表达与多种人类疾病有关，如高                            消化细胞并传代。将处于对数生长期的 SW620 细
                血压、骨关节炎、哮喘和精神分裂症等，但对结肠癌                           胞按 5×10 个/孔的密度种植于 6 孔板，待细胞生长
                                                                           4
                化疗耐药的影响尚不清楚。本研究运用体外实验                             至50%密度时，按照JetPEI试剂盒说明书，将siRNA⁃
                和临床标本验证 ZIP8 对结肠癌奥沙利铂耐药的影                         阴性对照（negative control，NC）和 siRNA⁃ZIP8 转染
                响，为结肠癌患者的预后和治疗提供理论基础。                             至SW620细胞，分别命名为siNC和siZIP8。
                                                                  1.2.3  实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR）
                1 材料和方法
                                                                      依据 TRIzol 试剂说明书，分别提取对数生长期
                1.1  材料                                           的 siNC 组和 siZIP8 组细胞总 RNA，根据 BeyoRTⅡ
                    人结肠癌细胞 SW620、Annexin V⁃APC 细胞凋                cDNA合成试剂盒说明书将总RNA逆转录为cDNA。
                亡检测试剂盒（南京凯基生物），siRNA⁃ZIP8（上海吉                     根据 BeyoFast SYBR Green 试剂盒说明书于 ABI
                玛制药），DMEM 培养基、胎牛血清、青霉素/硫酸链                        7500 实时荧光定量 PCR 系统上进行样本扩增，反
                霉素（Gibco 公司，美国），4×蛋白上样缓冲液（南京                      应体系如下：qPCR Mix10 μL、ZIP8/GAPDH 上下游
                诺唯赞），兔抗人 ZIP8 多克隆抗体（Abcam 公司，美                    引物（3 μmol/L）各 1 μL、cDNA 模板 2 μL、去离子
                国），JetPEI转染试剂（PolyPlus公司，法国）、RIPA试                水 6 μL。引物由南京金斯瑞生物有限公司合成，
                剂、兔抗人GAPDH 单克隆抗体、辣根过氧化物酶标                         ZIP8：上游 5′⁃ATGCTACCCAAATAACCAGCTC⁃3′，
                记的羊抗兔 IgG、Pierce ECL 曝光液（Invitrogen 公             下游 5′⁃ACAGGAATCCATATCCCCAAACT⁃3′；GAP⁃
                司，美国），TRIzol 试剂、BeyoRTⅡcDNA 合成试剂                  DH：上游 5′⁃CTGGGCTACACTGAGCACC⁃3′，下游
                盒、BeyoFast SYBR Green 试剂盒（上海碧云天生                  5′⁃AAGTGGTCGTTGAGGGCAATG⁃3′。每个样品设

                物），CCK⁃8 试剂盒（同仁公司，日本），Histostain SP               3 个复孔，实验重复 3 次。反应结束后，以 GAPDH
                免疫组化染色试剂盒（上海麦约尔）。                                 为内参照基因，计算各个样本扩增的 CT值，基因表
                    本研究包含 2014 年 1 月—2016 年 12 月在巴彦               达的相对定量采用2         -ΔΔCT 法。
                淖尔市医院进行治疗的结肠癌患者。纳入标准：组                            1.2.4  Western blot
                织学证实的结肠癌；局部晚期或远处转移，纳入研                                待siNC 组和siZIP8组细胞进入对数生长期，使
                究时判定无法完全切除；无传染性疾病或心脏病；                            用 RIPA 裂解液裂解细胞并提取总蛋白，与蛋白上
                肾、肝和骨髓功能正常；既往无结肠手术、化疗、放                           样缓冲液按比例混合，95 ℃加热10 min。将等量蛋
                疗史。本研究经过内蒙古医科大学伦理委员会批                             白注入 ExpressPlus PAGE Gel 预制胶，200 V 电泳
   76   77   78   79   80   81   82   83   84   85   86