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第43卷第9期 徐 洋，王 敏，张恒璐，等. 达格列净通过Rffl抑制STAT1/TGF⁃β1信号通路改善糖尿病肾病
2023年9月 肾小管上皮细胞EMT和纤维化［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（9）：1201-1207 ·1203 ·

组，使用含有5 μmol/L 达格列净的DMEM 高糖培养 A 1.5 B NC组 HG组
基培养48 h），高剂量达格列净+高糖组（Dap⁃H 组， Rffl 37 kDa
使用含有 10 μmol/L 达格列净的 DMEM 高糖培养基 1.0 α⁃Tubulin 50 kDa
培养 48 h），PCDH 组（PCDH 转至 HK⁃2 细胞，使用 Rffl mRNA相对表达量 0.5 *
DMEM高糖培养基培养48 h），PCDH⁃Rffl组（PCDH⁃ 0.8
0.6
Rffl转至HK⁃2细胞，DMEM高糖培养基培养48 h）。 0 NC组 HG组 Rffl蛋白相对表达量 1.0 *
1.2.3 Western blot检测 0.4
取按照上述分组培养48 h的各组细胞，加入适 0.2
量的 RIPA 细胞裂解液提取细胞中的蛋白，BCA 试 0 NC组 HG组
剂盒对蛋白进行定量，蛋白样品与上样缓冲液按照 A：qRT⁃PCR检测Rffl mRNA的相对表达量；B：Western blot检测
Rffl蛋白的相对表达量；与NC组比较，P < 0.05，n=3。
*
1∶5的比例充分混匀，100 ℃煮沸变性10 min，每个样
图1 不同浓度葡萄糖培养的HK⁃2中Rffl的表达水平
品取50 μg进行聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE）分
Figure 1 Rffl expression level in HK⁃2 cultured at differ⁃
离，90 V 低温电转移 2 h，5%的脱脂奶粉 37 ℃封闭 ent glucose concentrations
1 h，分别加入 E⁃cadherin、α⁃SMA、Fibronectin、Rffl、
TGF⁃β1、α⁃Tubulin 抗体，所有抗体均按照说明书稀 2.3 过表达Rffl抑制高糖环境中HK⁃2细胞的EMT
释，4 ℃过夜，TBST 洗涤，分别加入 1∶5 000 稀释的 和纤维化
HRP 标记的羊抗鼠IgG、羊抗兔IgG，室温孵育1 h，暗 与 NC 组相比，HG 组细胞中 E⁃cadherin 蛋白表
室内曝光显影，应用Image J软件分析各条带灰度值。 达水平降低，Fibronectin、α⁃SMA蛋白表达水平升高
1.2.4 RT⁃PCR检测 （P < 0.05，n=3）；与PCDH组相比，PCDH⁃Rffl组细胞
采用 TRIzol 法提取细胞中总 RNA，参照反转录 中 E⁃cadherin 蛋白表达水平升高，Fibronectin、α⁃
试剂盒合成 cDNA。以 cDNA 为模板进行 qRT⁃PCR SMA 蛋白表达水平降低（P < 0.05，n=3，图 3），提示
反应，PCR 循环条件：95 ℃ 30 s 预变性；95 ℃ 10 s， 过表达Rffl抑制高糖环境中HK⁃2的EMT和纤维化。
60 ℃ 30 s 共 40 个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 2.4 达格列净抑制高糖处理的 HK⁃2 细胞的 EMT
15 s 采集熔解曲线。以β肌动蛋白（β⁃actin）为内参， 和纤维化
采用2 -∆∆Ct 法计算Rffl mRNA的相对表达量。 与 NC 组相比，HG 组细胞中 E⁃cadherin 蛋白表
1.3 统计学方法 达水平降低，Fibronectin、α⁃SMA蛋白表达水平升高
所有实验数据采用SPSS 21.0软件进行分析，符 （P < 0.05，n=3）；与HG组相比，Dap⁃L组及Dap⁃H组
合正态分布的计量资料用均数±标准差（x ± s）表示， 细胞中 E⁃cadherin 表达水平均升高，Fibronectin、α⁃
两组比较采用 t 检验，多组间差异比较采用单因素 SMA 表达均降低（P < 0.05，n=3）；与 Dap⁃L 组相比，
方差分析，两两比较采用 LSD⁃t 检验，P < 0.05 为差
异有统计学意义。 A 200.0 B PCDH组 PCDH⁃Rffl组
Rffl mRNA相对表达量 100.0
Rffl
2 结 果 150.0 * α⁃Tubulin 37 kDa
50 kDa
2.0
2.1 Rffl在高糖培养的HK⁃2细胞中低表达 1.5
qRT⁃PCR 检测了低糖和高糖培养的 HK⁃2 细胞 1.0 1.0 *
0.5
Rffl 的表达水平，结果显示 HG 组细胞中 Rffl mRNA 0 PCDH组 PCDH⁃Rffl组 Rffl蛋白相对表达量 1.5
水平较NC组明显降低。Western blot检测结果证明 0.5
HG 组细胞中 Rffl 蛋白表达较 NC 组明显下调，差异
0
有统计学意义（P < 0.05，图1）。 PCDH组 PCDH⁃Rffl组
A：qRT⁃PCR检测Rffl mRNA的相对表达量；B：Western blot检测
2.2 在高糖培养的HK⁃2细胞中过表达Rffl
Rffl蛋白的相对表达量；与PCDH组比较，P < 0.05，n=3。
*
qRT⁃PCR 结果显示，转染重组质粒 PCDH⁃Rffl
图 2 重组质粒 PCDH⁃Rffl 转染后 Rffl 在 HK⁃2 中的表达
后，HK⁃2 中 Rffl 的表达水平与 PCDH 组相比明显上 水平
升。Western blot 结果与 qPCR 结果一致，表明成功 Figure 2 Expression level of Rffl in HK⁃2 after transfected
构建过表达Rffl的HK⁃2细胞（P < 0.05，图2）。 with recombinant plasmid PCDH⁃Rffl