Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第9期
·1202 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年9月

dapagliflozin + high glucose group were increased，but the expression levels of Fibronectin and α ⁃ SMA were decreased in a dose ⁃
dependent manner. Compared with the control group，the expression levels of STAT1 and TGF⁃β1 were increased in the high glucose
group，but significantly decreased after overexpression of Rffl or addition of dapagliflozin. Conclusion：Dapagliflozin inhibits STAT1/
TGF⁃β1 signaling pathway by up⁃regulating Rffl expression，and improves epithelial⁃mesenchymal transformation and fibrosis of renal
tubular epithelial cells in diabetic kidney disease.
［Key words］ dapagliflozin；diabetic kidney disease；Rffl；TGF⁃β1；EMT；fibrosis
［J Nanjing Med Univ，2023，43（09）：1201⁃1207］

糖尿病肾病（diabetic kidney disease，DKD）是糖
1 材料和方法
尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病（end
［1］
stage renal disease，ESRD）发生的主要原因 。DKD的 1.1 材料
病理特征是肾小球硬化、细胞外基质（extracellular 人肾小管上皮细胞 HK⁃2 细胞（上海中乔新舟
matrix，ECM）合成增加、肾小管萎缩和肾小管间质纤 公司）；胎牛血清、DMEM 高糖培养基（含有 4.5 g/L
维化 。越来越多的研究表明肾小管上皮细胞的 D⁃葡萄糖）、DMEM 低糖培养基（含有 1 g/L D⁃葡萄
［2］
上皮细胞⁃间充质转化（epithelial⁃mesenchymal tran⁃ 糖）、0.25%胰蛋白酶、链霉素、青霉素（Gibco 公司，
sition，EMT）及纤维化在 DKD 的进展中起重要作 美国）；达格列净（Med Chem Express公司，美国）；鼠
用，然而目前 DKD 的治疗仍以控制血糖、血压、调 抗上皮细胞钙黏蛋白（epithelial cadherin，E⁃cad⁃
节血脂为主要治疗原则，在抗纤维化方面效果并 herin）、纤连蛋白（Fibronectin）、STAT1、α⁃Tubulin 单
不明显 。 克隆抗体，兔抗α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth muscle
［3］
达格列净是一种钠⁃葡萄糖协同转运蛋白2（so⁃ actin，α⁃SMA）、TGF⁃β1、Rffl多克隆抗体、山羊抗兔二
dium⁃glucose transporter 2，SGLT⁃2）抑制剂，可以抑 抗、山羊抗鼠二抗（Proteintech公司，美国）；Trizol、质
制葡萄糖的重吸收，促进尿糖排出，降低血糖。近 粒转染试剂Lipofectamine 2000脂质体（Invitrogen公
TM
年来研究发现，达格列净还具有肾脏保护作用 ，然 司，美国），RT⁃PCR试剂（南京诺唯赞公司），RT⁃PCR
［4］
而其具体机制尚未明确。转化生长因子⁃β1（trans⁃ 引物（南京金斯瑞公司）；大肠杆菌DH5α（北京擎科
forming growth factor β1，TGF⁃β1）是作用最强的致纤 生物科技有限公司）；空载质粒PCDH和重组PCDH⁃
维化细胞因子，通过介导多种信号参与肾纤维化的 Rffl 质粒（广州易锦生物技术有限公司）；PCR 仪
［5］
发生发展 。信号转导与转录激活因子 1（signal （Eppendorf公司，德国）。
transducer and activator of transcription 1，STAT1）是 1.2 方法
STAT 转录因子家族成员，与高糖诱导的氧化应激、 1.2.1 细胞培养
TGF⁃β1的表达以及ECM蛋白Ⅳ型胶原蛋白和纤连 人肾小管上皮细胞HK⁃2在37 ℃、5% CO2的培养
［6］
蛋白（Fibronectin）的产生有关 。泛素蛋白酶体系 箱中用含有10%胎牛血清、1%青霉素（100 U/mL）和链
统是细胞内蛋白质降解的主要途径，可以严格调控 霉素（100 μg/mL）的 DMEM 培养基培养。细胞生长
TGF⁃β超家族信号转导。Rffl 是一种能抑制内体再 融合至80%时，用0.25%的胰酶消化细胞，细胞收缩
循环的 E3 泛素连接酶，可通过调控 PRR5L 降解促 变圆后加入完全培养基终止消化，传代。传代后的
进mTORC2介导的PKC⁃δ磷酸化从而延缓肺纤维化 细胞在 37 ℃、5%CO2 的培养箱中培养 24 h 后换液
进展 。然而 Rffl 在肾纤维化中的作用还未见报 1 次，以去除死亡的细胞，以后每 2 d 换液 1 次。取
［7］
道。设想达格列净的肾保护机制可能与上调Rffl的 对数生长期的细胞用于实验研究。
表达抑制STAT1/TGF⁃β1通路相关。 1.2.2 分组
本研究通过高糖培养肾小管上皮细胞模拟糖 收集对数期 HK⁃2 细胞，使用含 4.5 g/L 葡萄糖
尿病肾病环境，探讨达格列净是否通过上调 Rffl 的 的DMEM高糖培养基培养48 h，记作高糖组（HG组）；
表达抑制STAT1/TGF⁃β1信号通路从而改善DKD肾 使用含有 1 g/L 葡萄糖的 DMEM 低糖培养基培养
小管上皮细胞的EMT和纤维化，为DKD的治疗提供 48 h，记作对照组（NC 组）。收集对数期 HK⁃2 细胞
理论基础。 接种于 6 孔板，分为低剂量达格列净+高糖组（Dap⁃L